Mayor Capacidad de Muestra con una Columna Capilar EASY-Spray

Columnas Cabecera-Tit

Introducción

La columna capilar Thermo Scientific™ EASY-Spray™ 2 μm 15 cm × 150 μm sube el listón en proteómica aumentando en gran medida el número de muestras que pueden ser analizadas en laboratorios de proteómica en comparación con los métodos clásicos de nanoLC.

La LC Capilar ofrece ventajas en términos de facilidad de uso en comparación con nanoLC y mayor sensibilidad frente a LC analítica. La columna es totalmente compatible con LC’s Capilares Thermo Scientific™ y sistemas con Espectrómetros de Masas Thermo Scientific™ Orbitrap™ y ofrece una integración fácil de la velocidad, sensibilidad y robustez requeridas en flujos de trabajo de alto rendimiento en proteómica.

El diseño  EASY-Spray es un enfoque simple y fácil de tipo “plug and spray” diseñado para mejorar el rendimiento y es una alternativa novedosa a las columnas y fuentes clásicas de LC de bajo caudal. Al integrar esta tecnología con columnas de d.i. de 150 μm, se mejora todavía más la productividad mediante el aumento de la capacidad de los usuarios actuales de nanoLC, o aumentando la sensibilidad de los usuarios de LC de escala analítica.

Ventajas

  • Mayor sensibilidad frente a LC de Escala Analítica
  • Mayor rendimiento frente a experimentos de nanoLC
  • Columna robusta diseñada para proteómica de alto rendimiento
  • Diseñada para análisis LC-MS sin TFA, para minimizar los efectos de supresión iónica
  • Formato de fácil uso para LC Capilar

Tecnología de Columna

La columna EASY-Spray 15 cm x 150 μm está empaquetada con partículas Thermo Scientific™ Acclaim™ PepMap™ C18 2 μm 100Å y tiene un diámetro interno de 150 μm. Se usa en la separación de péptidos digeridos usados en la identificación de proteínas en aplicaciones de proteómica. La columna Acclaim PepMap ha sido diseñada para análisis sin TFA, minimizando los efectos de supresión iónica en experimentos de espectrometría de masas.

Aplicaciones

Superior Sensibilidad

Existe una clara relación experimental entre el caudal y la sensibilidad que puede describirse mediante una función exponencial (Figura 1). En consecuencia se pueden conseguir superiores incrementos en sensibilidad a caudales nano y capilar en comparación con caudales analíticos.

Figura 1. El incremento de sensibilidad experimentado en LC-MS de bajo caudal en comparación con el caudal LC-MS analítico.
Figura 1. El incremento de sensibilidad experimentado en LC-MS de bajo caudal en comparación con el caudal usada en LC-MS analítico.

La columna capilar EASY-Spray de 150 μm D.I. puede ser operada en un amplio rango de caudales entre 1 y 3 μL/min, que corresponden a velocidades lineares de 2 a 4 mm/s. Los resultados han mostrado que capLC-MS puede ser 40 veces más sensible que LC-MS a flujos analíticos de 450 μL/min y entre 2 a 4 veces menos sensible que nanoLC-MS a 300 nL/min (Figura 1), al cargar la misma cantidad de muestra en la columna*. (* El aumento o pérdida de sensibilidad dependen del compuesto y aplicación.) 

La columna EASY-Spray de 15 cm × 150 μm tiene un caudal óptimo de 3 μL/min al usarse en análisis de alta velocidad. El caudal óptimo para perfilado de muestras proteómicas con la plataforma capLC-MS de Thermo Scientific™ es de  1.2 μL/min, que ha mostrado ser ideal en estas aplicaciones. Las figuras 2 y 3 muestran cromatogramas típicos de separaciones capLC-MS a 3 y 1.2 μL/min y se puede comprobar que la resolución no se compromete a bajos caudales y es similar a las obtenidas a caudales analíticos.

Figura 2. Cromatograma típico de 1 pmol de digerido de proteína CytC en columna. Caudal: 3 μL/min. Presión: 450 bar
Figura 2. Cromatograma típico de 1 pmol en columna de digerido de proteína CytC. Caudal: 3 μL/min. Presión: 450 bar

La anchura de pico a media altura (PWHM) es de casi 3 s en separaciones rápidas de capLC-MS a 3 μL/min y de menos de 15 s en gradientes más largos a 1.2 μL/min, permitiendo capacidades de pico de aproximadamente 300 para ambos gradientes.

Figura 3. Cromatograma típico de 1 μg en columna digerido de lisado celular HeLa. Caudal: 1.2 μL/min. Presión: 200 bar
Figura 3. Cromatograma típico de 1 μg en columna digerido de lisado celular HeLa. Caudal: 1.2 μL/min. Presión: 200 bar
Robustez

Se ha comprobado la columna EASY-Spray 15 cm × 150 μm en una amplia secuencia de inyecciones en un sistema Thermo Scientific™ capillary-flow UltiMate™ 3000 RSLCnano capLC se configuró para inyecciones directas y evaluado durante 8 días de operación (Ver Figura 4a). Durante este período de tiempo se observó una excelente estabilidad de los tiempos de retención (RSD < 1%) en 350 inyecciones.

Figura 4a. Estabilidad del Tiempo de Retención de análisis cap LC-MS de digerido de proteína CytC.
Figura 4a. Estabilidad del Tiempo de Retención de análisis cap LC-MS de digerido de proteína CytC.

La estabilidad de las áreas de los picos se evaluó a nivel MS1 durante 150 inyecciones consecutivas efectuadas entre los días 5 y 8 (Figura 4b). Las áreas de pico alcanzaron valores RSD inferiores a 10% y se obtuvieron aún sin corrección de estándar interno durante tests a largo término.

Figura 4b. Estabilidad de Área de Pico en análisis cap LC-MS de digerido de proteína CytC.
Figura 4b. Estabilidad de Área de Pico en análisis cap LC-MS de digerido de proteína CytC.

Especificaciones Operativas

Figura6

Cómo Pedir

 

Figura7