En LC-Prep, ¡la presión no es tan importante!

Hasta hace pocos años los equipos destinados a purificaciones mediante Cromatografía de Baja Presión (FLASH) se diseñaban con el objetivo de ser simples y, en cierta medida, lo más económicos posible. El corazón del sistema es una bomba de muy alto caudal y baja presión.

Por otra parte los equipos LC-Prep eran la extensión lógica de los equipos de HPLC Analítica, con la salvedad de requerir bombas de mayor caudal y las altas presiones operativas, normalmente entre 150 y 400 bar y de coste muy elevado.

Por lo tanto hasta 2010-2011, el usuario que necesitaba purificar compuestos de síntesis o naturales tenía tres opciones:

  1. Purificar en columna con la consiguiente pérdida de tiempo y baja resolución (recuperaciones bajas o pureza pobre). El diseño de la separación normalmente se hace por Transposición de resultados obtenidos en Cromatografía de Capa Fina (TLC). La técnica más usual es la FASE NORMAL (FN o NP).
  2. Purificar en FLASH. Más rápido y eficiente que la purificación por gravedad con mejor recuperación y pureza. El método también se diseña por Transposición de TLC. La técnica más usual es la FASE NORMAL (FN o NP).
  3. LC-Preparatica (LC-Prep, HPLC-Prep) para obtener la máxima pureza y eficacia posible. El diseño de la separación normalmente se hace por Transposición de resultados obtenidos en UPLC o HPLC. La técnica más usual es la FASE INVERSA (FI o RP).

A partir de 2011 Interchim introduce el concepto de UPFP (Ultra Performance Flash Purification), que estrecha las diferencias en prestaciones entre Cromatografía FLASH y LC-Prep.

UPFP se basa en el uso de columnas FLASH de superior calidad, de partícula esférica y menor diámetro (50, 30 y 15 µm) que permiten obtener prestaciones muy cercanas a LC- Prep pero con las ventajas de FLASH: velocidad, capacidad de carga y un sensible menor coste.

La UPFP llena el hueco entre FLASH y LC-Prep
Figura 1 UPFP llena el hueco entre FLASH y LC-Prep

En 2012 Interchim introduce los equipos de muy alta presión (PF4125 y PF4250) que permiten FLASH y LC- Prep a elección del usuario sumando las ventajas de ambas técnicas.

UPFP permite las grandes capacidades de carga de las columnas FLASH con resoluciones cercanas a LC-Prep
Figura 2. UPFP permite las grandes capacidades de carga de las columnas FLASH con resoluciones cercanas a LC-Prep

Así es posible una Purificación Rápida con UPFP (FLASH), una Purificación de Alta Eficacia (LC-Prep) y, de manera muy fácil en equipos puriFlash, una limpieza previa rápida vía FLASH y la resolución del crudo limpio por LC-Prep.

¿Que equipos hay en el mercado?

Básicamente parece que todo se ha estabilizado en tres grandes líneas:

  1. Equipos FLASH Estándar con prestaciones instrumentales suficientes para el químico orgánico de síntesis que no está muy versado en cromatografía. De hecho estos equipos se denominan “Purificadores” mientras que lo más correcto sería LPLC (Low Pressure Liquid Chromatography). El 90% de las separaciones se hacen en Fase Normal (sílice) que es el método más simple, especialmente en cuanto respecta a la eliminación del solvente. Los equipos FLASH trabajan a grandes caudales (10-200 mL/min) y bajas presiones (10-14 bar).
    Se basan generalmente en bombas binarias, que pierden eficacia a medida que se aumenta la viscosidad del eluyente (los caudales máximos prometidos sólo se alcanzan con eluyentes de FN, como Hexano o Acetato de Etilo, pero con H2O o IPA pueden generar el 70 o 80% del caudal nominal).
  2. Equipos FLASH diseñados para UPFP.  Como en UPFP  las exigencias instrumentales son mayores (mayor presión y caudal máximo  sostenible en condiciones de Fase Inversa) las bombas ya son cuaternarias, y se diseñan como las de HPLC tradicional, para garantizar presiones más altas con solventes viscosos. Permiten el uso de columnas FLASH de Alta Resolución ( Fase de Partícula Esférica y tamaño de 30 o 15 μm). Algunos Equipos pueden tener la capacidad de usar columnas para LC-Prep (PF450), especialmente en condiciones de Fase Normal.
  3. Equipos LC-Prep, de prestaciones instrumentales mucho más altas y normalmente la elección del químico analista, más versado en cromatografía. Los caudales son medios (las columnas LC-Prep de gran diámetro son muy caras) y las presiones requeridas muy altas (al menos 100-150 bar). El 90% de las separaciones se hacen en Fase Inversa por transposición de métodos analíticos existentes.

Veremos en el apartado correspondiente, que bombas que generen presiones de 200 bar son más que suficientes para una purificación por LC-Prep en Fase Inversa (método que requiere más presión que los de Fase Normal).

Coste Operativo: ¿LC-Prep o UPFP?

Cuando hablamos del coste operativo hay que referirse tanto al gasto de eluyentes (de calidad estándar en UPFP, y de calidad HPLC en LC-Prep) como en el de columnas.

La Tabla 1 muestra las columnas más usadas en LC-Prep (15, 10 y 5 μm) y su equivalencia en UPFP (sólo 15 μm).

Tabla 1. Coste de columnas LC-Prep y UPFP. En negrita y cursiva las más usuales. Cuando se indican más de una columna éstas se usan en serie para simular la equivalente en LC-Prep. Por ejemplo 2 x F0025 corresponde a 2 columnas F0025 de dimensiones
Tabla 1. Coste de columnas LC-Prep y UPFP. En negrita y cursiva las más usuales. Cuando se indican más de una columna éstas se usan en serie para simular la equivalente en LC-Prep. Por ejemplo 2 x F0025 corresponde a 2 columnas F0025 en serie, equivalente a  una columna de 334x28mm.

Dos columnas UPFP de Fase Inversa C18 (FI o RP) de 21 x 133mm y 15 µm cuestan unos 160€ y una equivalente en LC-Prep unos 1.300€. Como ambas se pueden reutilizar, una columnas UPFP cuesta 8 veces menos que la equivalente LC-Prep, y como veremos con resultados también equivalentes.

En el caso de las columnas UPFP de SiO2 (FN), en principio no se recomienda la reutilización, pero su bajo coste (35€ frente a 900€) permiten usar columnas nuevas en cada purificación, que redunda en mayor productividad y calidad.

La cuestión de la presión

En 2012 Interchim presenta la nueva serie de alta presión (PF4125 y PF4250) que aúna alto caudal (250 mL/min) y alta presión hasta 250 bar (125 bar en 4125). La disponibilidad de un caudal y presión alto permiten tanto técnicas FLASH como LC-Prep, tanto en Fase Normal como Inversa.

El panorama se presenta ahora como sigue:

Tabla 1. Equipos LC-Prep, FLASH, UPFP y LC-Prep/UPFP usuales.
Tabla 2. Equipos LC-Prep, FLASH, UPFP y LC-Prep/UPFP usuales.

La Tabla 2 muestra los equipos más usuales para LC-Prep, FLASH, UPFP y LC-Prep/UPFP disponibles en el mercado. Salvo algunas excepciones (equipos no especialistas) las presiones máximas generadas por las bombas no superan los 200-280 bar.

¿Son necesarios equipos con presiones de más de 200 bar?

En principio con columnas de partícula de 5 μm y longitud de 250mm, no se requieren bombas de más de 200 bar.

Con los programas de simulación necesarios (HPLC Simulator,  LC Calculator o Column Backpressures & Mass Loads Calculator), resulta fácil generar la Tabla 3 siguiente:

Tabla 3. Pérdida de carga con diferentes eluyentes a 25 ºC para una columna de 250x4.6m y partícula de 5, 10 y 15um
Tabla 3. Pérdida de carga con diferentes eluyentes a 25 ºC para una columna de 250×4.6m y partícula de 5, 10 y 15um

Se puede ver que en las condiciones más adversas (columna de 250mm de longitud, partícula de 5 μm MeOH:H2O 50:50) se precisan 160 bar a 1 mL/min o 320 bar a 2 mL min.

La Tabla 4 muestra los caudales requeridos para una columna de diámetros entre 10 y 50 mm.

Tabla 4. Caudal necesario para mantener la misma velocidad lineal en columna.
Tabla 4. Caudal necesario para mantener la misma velocidad lineal en columna.

Analicemos las siguientes Figuras 2, 3 y 4, en las que se muestra la Pérdida de Carga (presión necesaria) en presencia de agua (Fase Inversa o RP) para columnas de 5, 10 y 15 µm, a caudal nominal y caudal 2X con Acetonitrilo (menos viscoso pero caro) y Metanol (más viscoso pero más económico) en condiciones de gradiente.

Se puede ver que con un 50:50 de agua:orgánico (viscosidad máxima) las presiones alcanzan 160 bar (unos 80 con Acetonitrilo), 40 bar (20 bar con ACN) y de sólo 18 bar (8 bar con ACN) con columnas de 5, 10 y 15 µm respectivamente. Si se dobla el caudal para reducir el tiempo de retención se doblarán las presiones…

Figura 2. Condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 5um.
Figura 2. Pérdida de Carga en condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 5 um.
Figura 3. Condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 10 um.
Figura 3. Pérdida de Carga en condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 10 um.
Figura
Figura 4. Pérdida de Carga en condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 15 um.

De las figuras puede deducirse que en las condiciones adecuadas en purificaciones en Fase inversa (en Fase Normal las presiones requeridas son mucho menores (ver Tabla 3), como:

  • Baja viscosidad (Acetonitrilo en lugar de Metanol)
  • Tamaño de partícula razonable para una buena purificación (10, 15 μm
  • Longitud de columna razonable (100, 150 mm)

¡Hasta un equipo de media presión como PF450, puede trabajar sin ningún problema con columnas para LC-Prep!

Las Figuras 5, 6 y 7 muestran que hasta con columnas de 15 μm se pueden efectuar purificaciones muy eficientes, y económícas ¡si se utilizan columnas UPFP de 15 μm!

Figura 5. Con columnas de 15 um se pueden conseguir buenas puroficaciones tanto en LC-Prep com en UPFP.
Figura 5. Con columnas de 15 um se pueden conseguir buenas purificaciones tanto en LC-Prep como en UPFP.
Figura 6. Las columas con partícula de 10 um mejoran la resolución y generan muy poca contrapresión. Sólo disponibles en formato LC-Prep.
Figura 6. Las columnas con partícula de 10 um mejoran la resolución y generan muy poca contra presión. Sólo disponibles en formato LC-Prep.
Figura 7. La máxima eficacia se obtiene dismuniyendo el tamaño de partícula a costa de aumentar la pérdida de carga y el coste de la columna.
Figura 7. La máxima eficacia se obtiene disminuyendo el tamaño de partícula a costa de aumentar la pérdida de carga y el coste de la columna.

Otros efectos a tener muy en cuenta

1. El diámetro interno de la columna

Se ha indicado(1) que existen efectos extracolumnares que pueden afectar a la eficacia de la columna como la resistencia a la transferencia de masas.

Mientras que en columnas de 4.6 a 21.2 mm di D.I. la representación de la curva de van Deemter (H/u) es similar y sigue la teoría (menor diámetro H menor) en cuanto se aumenta mucho el diámetro entran en juego otros factores como la disipación del calor causado por la fricción que causa que el relleno de la columna (básicamente sílice  (0.53 μm/m/ºC) se expanda muy diferentemente que la columna metálica (16 μm/m/ºC) con el peligro de la formación de canales preferentes.

Figura 8. Influencia del diámetro de la columna en la curva H/u. Material de empacado de 10 y 20 um.
Figura 8. Influencia del diámetro de la columna en la curva H/u. Material de empacado de 10 y 20 um.

2. El tamaño de la partícula

La influencia del tamaño de la partícula es importante en Cromatografía Preparativa. La Figura 9 muestra el efecto del tamaño de partícula en la curva H/u tanto en condiciones analiticas (1 μg/10μL) como en condiciones de carga (100 μg/10μL).

Figura 9. Influencia del tamaño de la partícula en la curva H/u.
Figura 9. Influencia del tamaño de la partícula en la curva H/u.

Es evidente que tanto la capacidad de carga y la eficacia (o velocidad) aumentan al disminuir el tamaño de partícula a expensas de una mayor contra presión generada.

3. La dispersión del tamaño

¿Vale la pena usar rellenos diseñados para LC Analítica en LC Preparativa?

En principio parecería la opción más interesante pero ¿es realmente necesaria). Una fase estacionaria desarrollada para una cromatografía eficiente ha de mantener una dispersión mínima de tamaños de partícula (relación dp 90/dp 10). En HPLC analítica la relación dp 90/dp 10 usualmente es inferior a 1.5. El hecho es que una dispersión mayor, aunque disminuye la eficacia, aumenta también la contra presión generada frente a otra fase con una dispersión menor que se puede empacar de manera más eficiente.

Con las partículas mayores que se suelen usar en Cromatografía preparativa se observa el mismo efecto: mayor eficacia y menor contrapresión. El efecto negativo es el precio que suele ser bastante mayor.

En la Figura 10, se muestra, sin embargo, que el efecto de la mayor dispersión no afecta demasiado a la eficacia y que, por lo tanto compensa el uso de una fase más dispersa aunque genere mayor contra presión. Se han comparado dos fases equivalentes, RSil-C18-HL-D de 20μm (dp 90/dp 10=1.6) y Prep RSil-C18-HL-D de 20μm (dp 90/dp 10=3.6).

Figura 10.
Figura 10. Influencia de la distribución del tamaño de partícula en la curva H/h. Columnas de 250×4.6mm y 20 um

La columna con distribución de tamaño de partícula más estrecha genera menos contra presión que la segunda (Factor de Resistencia 980 y 1890 respectivamente), aunque la diferencia en eficacia no es excesiva. En columnas con fases estacionarias de partícula tan grande las diferencias de pérdida de carga no son tan importantes, puesto que las contra presiones generadas son casi siempre muy bajas.

4. Efectos extra columnares

Los caudales de eluyente requeridos en LC-Prep son altos (Ver Tabla 4) y no se pueden despreciar los efectos extra columnasres como son el diámetro interno de los tubos de interconexión que, especialmente en condiciones de Fase Inversa, pueden generar pérdidas de carga importantes.

Tabla Viscosidad
Figura 11. Viscosidad en cP de diferentes mezclas de Acetonitrilo:Agua y Metanol:Agua a diferentes temperaturas.

La Figura 11 muestra la variación de viscosidad(2) a diferentes concentraciones de mezclas binarias MeOH:H2O y ACN:H2O que son las más usuales en Cromatografía de Fase Inversa.

El  Metanol en Agua entre 40÷50% tiene una viscosidad de 1.83 cP, mientras que el Acetonitrilo, bastante más caro, tiene un máximo de 1.23 cP entre 20÷30% en agua.

Figura 12. Pérdida de Carga generada por tubos de 1/16" a caudales nominales de columna de varios D.I.
Figura 12. Pérdida de Carga generada por tubos de 1/16″ a caudales nominales de columna de varios D.I.

La mayor viscosidad no sólo genera una gran pérdida de carga en columna (Ver Figuras 2, 3 y 4), sino que también los accesorios extra columnares como tubo, conectores válvulas y otros, también pueden ser fuente de importantes contra presiones.

La Figura 12 y la Tabla 5 muestran que 100cm de tubo de 1/16″ de D.I. de 0.503mm ya genera una pérdida de carga importante con eluyentes tipo agua/metanol o agua/acetonitrilo en condiciones usuales en LC-Prep de Fase Inversa. (Datos de presión calculado en Pressure Drop Online-Calculator).

Tabla 5. Pérdida de Carga en un tubo recto de 1/16"x 100cm de 0.508 y 0.762 mm D.I. con H2O:MeOH 50:50
Tabla 5. Pérdida de Carga en un tubo recto de 1/16″x 100cm de 0.508 y 0.762 mm D.I. con H2O:MeOH 50:50

La Tabla 6 (Fuente Swagelok Tubing Data) muestra las especificaciones de tubos de acero inoxidable 316 de 1/16″. Con los criterios de seguridad usuales, un tubo de 1/16″ no ha de tener paredes de menos de 0.5mm para suportar con seguridad presiones de más de 400 bar.

Tabla 5. Pérdida de carga generada por tubos de D.I. de
Tabla 5. Presiones máximas para tubos de 1/16″

6. Bibliografía

  1. M. Verzele and C. Dewaele. Preparative HPLC. A Practical Guide. Ed. Tec. Gent. Belgium. 1986
  2. Introduction to Modern Liquid Chromatography (.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.W. Dolan, Willey, 2010, 3rd. ed)