Análisis de Catequinas y Ácidos Fenólicos en Vino Tinto mediante Extracción en Fase Sólida y HPLC

Introducción

VasoVino

Los polifenoles presentes en la dieta comprenden un amplio rango de compuestos aromáticos que son responsables de las numerosas características organolépticas de alimentos y bebidas de origen vegetal. Además de las propiedades de color y sabor, se ha indicado que los polifenoles poseen características antioxidantes, haciéndolos responsables de las ventajas saludables del fruto, vegetal y bebidas derivadas.

Los polifenoles presentes en los alimentos se pueden dividir en dos grupos principales: flavonoides y no-flavonoides. Los no flavonoides son, en su mayoría, ácidos monocíclicos y pueden dividirse, a su vez, en dos sub-clases principales: ácidos fenólicos y estilbenos (por ejemplo el resveratrol). Los ácidos fenólicos se subdividen en ácidos benzoicos y ácidos hidroxicinámicos.

Los flavonoides comparten un núcleo común consistente en dos anillos fenólicos y un heterociclo oxigenado. Forman una gama diversa de compuestos que pueden categorizarse en muchas clases como antocianos, flavonoles (por ejemplo quercetina), flavanoles (como las catequinas) y chalconas.(1)

El grupo de catequinas de los flavanoles son los componentes mayoritarios en el vino y se han indicado sus propiedades antioxidantes, antimicrobianas, antimutagénicas y anticarcinogénicas. Algunas de las catequinas principales se muestran en la Figura 1.

Figura 1: Catequinas a Catequina; b Epicatequina; c Galato de Galocatequina
Figura 1. Catequinas
a Catequina; b Epicatequina; c Galato de Galocatequina

La presencia de polifenoles en productos vegetales es muy variable. Algunos compuestos son ubicuos, mientras que otros son específicos de especies determinadas. Las condiciones ambientales, los estados de madurez, las variaciones genéticas y parte del fruto considerada (piel, pulpa…) causan grandes variaciones en la concentración de esos compuestos. Los polifenoles son especies altamente inestables y por estas razones su análisis puede resultar muy difícil. Sin embargo, puesto que los polifenoles contribuyen al gusto, apariencia y en la formación de aromas poco apetecibles en alimentos y bebidas, los estudios sobre su composición han ganado interés en los últimos años(2).

La mayoría de las substancias fenólicas son solubles en agua y aromáticas; por lo tanto la técnica analítica a elegir es HPLC por Fase Inversa y detección UV. Sin embargo, debido a su similitud estructural, su análisis requiere una elevada resolución y selectividad cromatográfica.

El método descrito en esta aplicación usa una columna HPLC Accucore PFP (PentaFluoroPhenyl) que permite la determinación rápida y eficiente de varias catequinas y otros polifenoles en vino tinto en condiciones de HPLC por gradiente.

Las columnas Accucore usan la Tecnología Core Enhanced Technology™ para facilitar separaciones rápidas y eficientes. las partículas de 2.6 μm no son totalmente porosas al tener un núcleo sólido y una capa superficialmente porosa. El enlace optimizado del soporte crea una serie de fases robustas y de alto recubrimiento. El control estricto de las partículas de 2.6 μm de Accucore generan contrapresiones mucho menores que la normalmente vistas en partículas sub-2 μm. La presencia de grupos fluorados en la fase PFP causa cambios significativos en las interacciones analito / fase estacionaria, y permite el análisis de compuestos polares que tengan grupos funcionales hidroxilo, carboxilo, nitro u otras especies polares. Además su selectividad se hace más evidente si los grupos funcionales están localizados en un anillo aromático, así que la columna HPLC Accucore PFP resulta una candidata ideal para el análisis de polifenoles y catequinas.

El tratamiento de la muestra, en el caso de los vinos, requiere una Extracción en Fase Sólida (SPE). En esta aplicación se muestra la versatilidad de HyperSep Retain PEP (Polar Enhanced Polymer), basada en un material altamente poroso de alta pureza tipo divinilbenceno, modificado con grupos urea. Este material ofrece recuperaciones excepcionales con analitos polares y apolares. Además, la estabilidad en el rango de pH 0-14, la rápida preparación de las muestras, el rápido desarrollo de los métodos, y recuperaciones consistentes son atributos clave de HyperSep Retain PEP como se mostrará aquí.

Experimental

Condiciones HPLC

Estándares Analíticos

Los estándares analíticos primarios de catequina, epicatequina, gallocatequina gallato, ácido siríngico, hidroxibenzaldehído, p-vanillina, miricetina, resveratrol y quiercetina se prepararon separadamente. Los estándares de catequina, epicatequina, gallocatequina gallato, ácido siríngico, hidroxibenzaldehído y p-vanillina se prepararon en agua. Los estándares de miricetina, resveratrol y quiercetina se prepararon en agua:metanol (50:50 v/v). El Estándar de trabajo se preparó combinando 1 mL de cada estándar primario.

Desarrollo del método de Extracción en Fase Sólida

El procedimiento de extracción se optimizó mediante un perfil de elución para determinarlas mejores condiciones de lavado y elución en EFS (SPE), mediante la adición de 2 mL de estándar de trabajo (en agua) en los cartuchos HyperSep Retain PEP y acondicionamiento y equilibrado con 2 mL de Metanol y agua, respectivamente.

Se aplicaron lavados con fuerzas elutrópicas crecientes de solvente empezando con 0:100:0.1 (v/v/v) Metanol:Agua:Ácido Fórmico 0.1% e incrementando un 10% por etapa hasta 100:0:0:0.1 Metanol:Agua:Ácido Fórmico 0.1%.

Se efectuaron 4 lavados con 1 mL de metanol 100%, se colectó dada uno y se analizó por HPLC. Los datos obtenidos se presentan en la Figura 2 que muestra unas condiciones de lavado óptimas con 20% Metanol antes de que los compuestos empiecen a eluir del cartucho. La Figura 2 muestra que un solvente de elución al 90% tiene la fuerza suficiente para eluir todos los componentes. Sin embargo se usó una solución 100% metanólica para reducir el tiempo empleado en la etapa de evaporación de solvente.

Figura 2. Perfil de elución de catequinas y compuestos fenólicos en HyperSep Retain PEP
Figura 2. Perfil de elución de catequinas y compuestos fenólicos en HyperSep Retain PEP
Análisis de la Extracción en Fase Sólida

El procedimiento de extracción optimizado se realizó con mezclas de compuestos fenólicos y catequinas disueltos en una matriz de vino (Ver Tabla 1). Las mezclas estándar se prepararon a seis puntos de concentración (Std1 – 11, ver Tabla 2) mediante diluciones en serie del Estándar de trabajo. El vino seleccionado en este estudio fue un Bonanza Shiraz tinto de Argentina (año 2010). Con la muestra de vino se aplicaron los mismos procedimientos de extracción usados con las mezclas estándar. La muestra de vino se diluyó en agua en un factor de tres antes de la EFS (SPE) y antes del fortificado con las muestras estándar para asegurar la retención de los analitos.

Tabla 1. Procedimiento EXtracción en Fase Sólida
Tabla 1. Procedimiento Extracción en Fase Sólida

Condiciones Cromatográficas

Condiciones HPLC

Resultados

En las condiciones adoptadas en este análisis se consigue una buena retención y la separación a línea de base de nueve moléculas polares en aproximadamente cinco minutos, con un tiempo total de análisis de diez minutos incluyendo el equilibrado final. (Ver Figura 3)

Figura 3. Cromatograma de la mezcla estándar 1 que contiene (en orden de elución): 1. Catequina; 2. Epicatequina; 3. Ácido Siríngico; 4. Galato de Galocatequina; 5. Hidroxibenzaldehído; 6. p-Vanillina; 7. Miricetina; 8. Resveratrol; 9. Quercetina
Figura 3. Cromatograma de la mezcla estándar 1 que contiene (en orden de elución): 1. Catequina; 2. Epicatequina; 3. Ácido Siríngico; 4. Galato de Galocatequina; 5. Hidroxibenzaldehído; 6. p-Vanillina; 7. Miricetina; 8. Resveratrol; 9. Quercetina

La Tabla de calibración se preparó a partir de mezclas de estándares en vino con seis puntos de concentración (Std 1-11) preparadas por dilución de la solución madre de trabajo.

La Tabla 2 resume las concentraciones de catequinas y polifenoles en una muestra de vino tinto Bonarda Shiraz fortificada con las mezclas estándar.

Tabla 2. Niveles de Concentración de las mezclas de catequinas y compuestos fenólicos fortificados en la muestra de vino con excatitudes y recuperaciones. N/A indica que no se usó ese nivel de concentración para ese compuesto
Tabla 2. Niveles de Concentración de las mezclas de catequinas y compuestos fenólicos fortificados en la muestra de vino con excatitudes y recuperaciones. N/A indica que no se usó ese nivel de concentración para ese compuesto

Se verificó la linearidad en la respuesta del detector en los rangos de concentración investigados (Ver Tabla 2) con coeficientes de correlación superiores a 0.995 en los nueve analitos. La Figura 4 muestra la linearidad del detector para la catequina (en las concentraciones de la Tabla 2), compuesto seleccionado como representativo de las respuestas lineares de los compuestos fenólicos investigados en esta aplicación.

Las recuperaciones se calcularon por comparación de la respuesta del detector de las mezclas estándar extraídas frente a mezclas no extraídas de la misma concentración (Ver Tabla 2). La Exactitud se se muestra también en la Tabla 2.

Figura 4. Recta de calibrado para la Catequina
Figura 4. Recta de calibrado para la Catequina

Conclusiones

En esta aplicación se ha desarrollado un método para el análisis y cuantificación por HPLC de nueve catequinas y ácidos fenólicos presentes en vino tinto. Para extraer esos compuestos polares se ha utilizado material de EFS HyperSep Retain PEP que ha mostrado una recuperación excelente. Los polifenoles de los extractos se cuantificaron mediante una calibración matriz-estándar, con extractos de un vino fortificado con cantidades crecientes de analitos. La selectividad única ofrecida por la columna HPLC Accucore PFP ha permitido una separación excepcional de estos compuestos muy parecidos estructuralmente.

Referencias

  1. H.S. Lee, B.W. Widmer. Phenolic compounds. In: L.M.L. Nollet, ed. Handbook of food analysis. New York, Marcel Dekker, 1996, 821-894.
  2. M. del Alamo, L. Casado, V. Hernandez, J. J. Jimenez, J. Chromatogr. A, 2004, 1049, 97-105.