Seis consideraciones que mejorarán sus resultados en HRGC

Zonas críticas de un HRGC
Zonas críticas de un HRGC

La selección de los accesorios y columna para GC resulta crítica para asegurar unas prestaciones óptimas de su instrumento.

Le proponemos analizar paso a paso qué accesorios son los más aconsejables para obtener los resultados esperados en función de la naturaleza de la muestra a analizar.

Consideraremos los puntos siguientes:

  • Viales
  • Jeringas
  • Membranas (septas)
  • Liner (Insertos de Inyector)
  • Conectores y Ferrulas
  • Columnas

1. Use los viales adecuados

Viales-1Thermo ScientificTM Viales SureStopTM y cierres AVCS: la próxima generación de viales para manipulación de muestras

No siempre el producto más económico es el más adecuado. En este estudio se han valorado las pérdidas por evaporación y los efectos causados por una membrana mal alineada o sobre apretada en viales roscados de 9mm o con cápsula de 11mm.

El test se realizó añadiendo 1.3 mL de Metanol a 50 viales que se incubaron a 40ºC durante 72 horas. Tras el período se obtuvo el peso final y se substrajo del peso inicial a 40ºC para obtener la pérdida de muestra en gramos.

Ventajas de los Cierres SureStop frente a los convencionales
Ventajas de los Cierres SureStop frente a los convencionales

Viales-12

¿Usa viales para encapsular?

Cambiar a Viales SureStopTM y cierres AVCS le permitirá:

  • Eliminar el encapsulado: no hacen falta herramientas de encapsular o desencapsular. Los tapones roscados son más fáciles de poner o quitar reduciendo el tiempo empleado en la manipulación de muestras. Además se eliminan efectos de stress causados por grandes volúmenes de encapsulado que se reducen con viales roscados.
  • Los Viales SureStopTM y cierres AVCS ofrecen las mismas prestaciones que los viales para encapsular (basado en estudios de pérdida de solvente) que hace que los productos SureStopTM sean una alternativa viable en GC.
  • Los Viales SureStopTM y cierres AVCS producen una hermeticidad “como encapsulada” y permiten una cuantificación fiable aún con compuestos de bajo punto de ebullición. Se elimina la variabilidad causada por el cierre subjetivo del usuario o cuando se “espera” queel vial esté cerrado adecuadamente.
Con los Viales SureStop es imposible el sobreapriete.
Con los Viales SureStop es imposible el sobreapriete.

2.  Use la Jeringa adecuada

Jeringa-2La jeringa juega un papel importante en un GC pues toma la muestra del vial y la introduce en el inyector. Hay una gran posibilidad de error al seleccionar la jeringa correcta debido al amplio rango de inyectores de diferentes fabricantes y de sistemas de inyección automática.

Una vez seleccionada la jeringa más adecuada para el inyector o inyector automático, se han de considerar otros parámetros como el diámetro de la aguja y tipo de punta.

Selección del diámetro de la aguja
  • El diámetro de la aguja (“gauge”) es una medida del “grosor” de la aguja
  • Mayor es el valor más fina es la aguja: una aguja 26 es más fina que otra 23
  • El sufijo “s“, por ejemplo 23s, indica una aguja de diámetro interno más estrecho.
  • Es conveniente usar la aguja más gruesa posible para evitar su rotura.
Selección de la punta de la aguja
Selección del tipo de aguja de la jeringa de inyección en función de la aplicación
Selección del tipo de aguja de la jeringa de inyección en función de la aplicación
Volumen de inyección

Para unas prestaciones óptimas, se recomienda que el volumen de inyección sea de al menos el 10% del volumen total. Como demostración, una inyección de un volumen de 1 µL se ha repetido 20 veces con jeringas de diferente volumen, inyectando una solución modificada tipo Grob (10 µg/mL) en isooctano.

Los gráficos muestran el área obtenida para la 2-Octanona.

Inyección repetida 20 veces de 1 uL con una jeringa de 5 uL. RSD% 1.339.
Inyección repetida 20 veces de 1 uL con una jeringa de 5 uL. RSD% 1.339.
Inyección repetida 20 veces de 1 uL con una jeringa de 10 uL. RSD% 2.306.
Inyección repetida 20 veces de 1 uL con una jeringa de 10 uL. RSD% 2.306.

Inyección repetida 20 veces de 1 uL con una jeringa de 25 uL. RSD% 6.083.

Inyección repetida 20 veces de 1 uL con una jeringa de 25 uL. RSD% 6.083.

Mantenimiento de las Jeringas

La vida útil de las jeringas puede alargarse notablemente si se siguen las siguientes recomendaciones:

  • Lavar las jeringas diariamente con el solvente en que las muestras sea solubles, como metanol o acetonitrilo
  • Después del uso de cada jeringa, lavarla con 3 o 5 volúmenes de solvente
  • No manipule el émbolo cuando la jeringa esté seca
  • No sumerja nunca su jeringa en solvente: los adhesivos de la aguja se podrían dañar
  • No substituya el émbolo si su jeringa no es GT (Gas Tight), puesto que el barril y émbolo se ajusta en fábrica. Las jeringas de tipo GT admiten la substitución del émbolo.

Jeringa-2TFinal 2

El material particulado insoluble presente en las muestras puede bloquear la jeringa tras un uso repetido, con el resultado fatal que se muestra en la figura de la izquierda.

El lavado efectivo de la jeringa entre inyecciones resulta crítica y el prefiltrado de la muestra puede ser eficaz si la presencia de material particulado en la muestra resulta ser excesivo.

Recuerde que sólo las Jeringas de tipo GT (Gas Tight) permiten la substitución del émbolo.

No intente intercambiar los émbolos de las jeringas normales: ¡se puede producir un gripaje irresoluble!

3. Use la Membrana de Inyector correcta

Septa-3La membrana del inyector es un componente clave en la introducción de muestra en un GC. Su propósito es ofrecer una barrera que pueda ser fácilmente penetrada por la aguja del inyector y, al mismo tiempo, mantener la presión interna sin contaminar el análisis.

La membranas se suministran en una amplia gama de tamaños y materiales según las especificaciones del sistema de inyección. El material que generalmente se usa son siliconas de alta temperatura y bajo sangrado.

Se debe seleccionar la membrana en función de la temperatura máxima a la que se va a someter en el inyector.

Los materiales para temperaturas más bajas son, en general, más blandos, sellan mejor y aguantan muchas más inyecciones que los materiales diseñados para temperaturas más altas.

Si se usa una membrana por encima de sus limites de temperatura puede fugar o descomponerse en el inyector, con el consiguiente pérdida de prestaciones cromatográficas y menor vida de la columna por las eventuales entradas de aire en el sistema.

Porqué se ha de substituir regularmente las membranas de inyector:
  • Evitar fugas en el sistema
  • Reducir pérdidas de muestra
  • Evitar la descomposición de la membrana en el inyector
  • Alargar la vida de la columna
Menbrana BTO tras más de 200 inyeccines
Menbrana BTO tras más de 200 inyeccines
Materiales Usados en las membranas

Membrana-1T

Tipos de Membrana
MEMBTOBTO (Bleed & Temperature Optimized)
  • Material de bajo sangrado y alta temperatura
  • Optimizado paraGCMS
  • Temperatura máxima 400ºC
  • Pretroquelado
  • En jarras de vidrio o blisters individuales
MEMTHONMarathon
  • Material de alta resistencia: hasta 400 inyecciones por membrana
  • Temperatura máxima 350ºC
  • Pretroquelado
  • En jarras de vidrio o blisters individuales
MEMGREENTR-Green
  • Material de gran resistencia y vida útil con mínima adherencia al inyector
  • Temperatura máxima 350ºC
  • Pretroquelado
  • En jarras de vidrio o blisters individuales
MEMBLUETR-Blue
  • Aplicaciones de rutina
  • Temperatura máxima 200-250ºC
  • Fácil penetración
  • Envasado en jarras de vidrio o blisters

 

4. Use el Liner (Insertos de Inyector) adecuado

Liner-4El liner tiene un cometido muy importante en un equipo GC: permite que la muestra inyectada pase a fase gas hacia la columna. La elevada temperatura a la que se mantiene vaporiza la muestra y los vapores se transfieren a la columna.

Durante esta transición de fase se provoca un incremento de volumen significativo y el vapor producido ha de poder ser contenido en el volumen interno del liner. Si el volumen de expansión es demasiado grande, se puede perder parte de la muestra, o, en el peor de los casos, contaminar el sistema neumático, provocando una reproducibilidad y sensibilidad pobre.

Tipos generales de Liner
Tipos generales de Liner
Los puntos clave a considerar son:
  • Diámetro Interno y Geometría del Liner
  • Tipo de Inyección
  • Materiales de relleno del liner
  • Tratamiento y desactivación del liner
¿Por qué es necesario substituir regularmente el liner?
  • Para mantener una reproducibilidad consistenet
  • Evitar la degradación de la forma de los picos
  • Evitar la descomposición de la muestra
  • Evitar picos fantasma
Diámetro Interno y geometría

Liner-Recto

Un liner recto para split de 78.5x4mm tiene un volumen interno de 986uL.

Los factores siguientes reducen su volumen efectivo:

  • Deflectores, Estrechamientos o otras variantes del liner
  • Materiales de Relleno
  • Gas portador

Como regla general la nube de vapor creada por la muestra no debería superar el volumen total del liner. El volumen de expansión de los solventes limitan el volumen inyectable: los solventes de baja densidad y mayor masa molar son más preferibles pues el volumen de muestra a inyectar puede ser mayor sin generar un volumen de gas en expansión excesivo.

Las figuras muestran el efectos de diferentes solventes y diferentes volúmenes de inyección en la forma de los picos.

LINERISOOCTANO

LINERDCMACN

Tipo de inyección

El tipo de inyección es clave en la selección del liner adecuado.

Los liners para inyección en Split (con división) normalmente son rector y de extremos abiertos para que el caudal de split pase por la parte inferior , eliminando parte de la muestra, y efectuado la división entre la salida del inyector y la entrada en la columna:

Liner-Recto
Típico Liner para inyección en Split. Notar los extremos abiertos.

Los liners para inyección en Splitless (sin división) tienen generalmente una restricción en la parte inferior con la columna insertada a través e la misma. La restricción permite aislar los vapores e la muestra de los componentes metálicos (y reactivos) del inyector durante el tiempo que la válvula de split permanece cerrada (tiempo de Splitless)

Liner-SPLESS
Liner par Splitless. Notar el estrechamiento inferior por donde para la columna.
Selección incorrecta del Liner
Un liner incorrecto causa severas distorsiones en la forma de los picos con la consiguiente pérdida de eficacia.
Un liner incorrecto causa severas distorsiones en la forma de los picos con la consiguiente pérdida de eficacia.
Selección Correcta del Liner
El liner adecuado a la técnica de inyección permite obtener la eficacia máxima
El liner adecuado a la técnica de inyección permite obtener la eficacia máxima
¿Liner con relleno?

Los dos cromatogramas muestran la inyección número 50 de un estándar de Endrin y DDT. El primer cromatograma es el resultado de usar un liner vacío y desactivado.

El segundo muestra la misma mezcla pero usando un inserto desactivado con relleno.

LINER-VA_LLE
La presencia de zonas activas se muestra por la degradación del Endrín a Endrín Aldehído y Endrin Cetona
La Desactivación del Liner

Los liners de la serie Themo ScientificTM GOLD aseguran una superficie altamente inerte para un amplio rango de compuestos mediante un proceso prpietario de desactivación.

Usando el Test de Actividad con DDT y Endrin (vea más detalles siguiendo el enlace) se generan los gráficos siguientes:

Degradación del compuesto tras 50 inyecciones. El LinerGOLD muestra una degradación mínima.
Degradación del compuesto tras 50 inyecciones. El LinerGOLD muestra una degradación mínima.

5. Conectores y Ferrulas

Las μ-uniones SilTite

Ferrula-5La μ-unión SilTite es un conector para unir columnas capilares o precolumnas a columnas de volumen muerto cero. La unión tiene una muy baja masa térmica mide unos 9mm y su masa es inferior a 0.5g.  (Puede obtener más información siguiendo este enlace).

La μ-unión SilTite ofrece:

  • Volumen muerto cero para ofrecer formas de pico óptimas.
  • Tecnología FingerTite. Simple y de apriete manual.
  • Altamente inerte y robusta.
  • Uniones absolutamente estancas.
  • Para columnas de 0.1 hasta 0.53mm (DI)

El cromatograma siguiente muestra que, tras 500 programas de temperatura de 100 a 280ºC, la unión se mantienen completamente estanca: sin fugas desde el programa 9 hasta el programa 499.

Sin Fugas tras 500 ciclos de temperatura.
Sin Fugas tras 500 ciclos de temperatura.
Ferrulas

El propósito de las ferrulas es sellar la conexión de la columna o del liner al sistema HRGC. Usar una ferrula equivocada u otra de baja calidad puede causar cromatogramas inconsistentes y poco reproducibles. Las fugas ocasionadas por ferrulas inorrectas permite que el aire y otros contaminantes entren en el sistema, causando interferencias con la columna y el detector.

Para asegurar unas prestaciones óptimas, la ferrula debería cambiarse cada vez que se substituya la columna o se proceda al mantenimiento de la misma.

Ferrulas-1T

¿Cuándo hay que cambiar una ferrula?

Ferrula-USNU

Minimizar los problemas asociados con ferrulas
  • No las sobre apriete
  • Asegúrese que la ferrula está limpia antes de su uso
  • Evite contaminarlas
  • Si es necesario púrguelas en un horno antes de su uso
  • Cambie la ferrula con cada columna
  • Cambie la ferrula con cada liner
  • Use la ferrula adecuada al D.I. de su columna

6. Las Columnas

La columna de un cromatógrafo de gases es el elemento que efectúa la separación, y, para optimizarla, muchos parámetros tienen importancia:

  • Longitud de la Columna
  • Diámetro Interno de la Columna (D.I.)
  • Espesor de Film
  • Química de la Fase

Las columnas para Cromatografía de gases se suministran con dos temperaturas máximas operativas: el límite isotermo a la que la columna puede someterse continuamente y una temperatura máxima en programación que se puede mantener únicamente durante breves períodos de tiempo.

A veces se indica también una temperatura mínima por debajo de la cual la columna operará con muy bajas prestaciones.

Si la columna se lleva continuamente a la temperatura máxima operativa se observará lo que se llama “sangrado” de la columna, que es el ruido de fondo causado por la degradación de la fase estacionaria y aumenta al aumentar el espesor de film y las dimensiones de la columna. Resulta importante, pues, minimizar los efectos del sangrado intentando no alcanzar las temperaturas máximas de servicio.

Límites máximos de Temperatura en una Columnas HRGC típica
Límites máximos de Temperatura en una Columnas HRGC típica

Cuando la columna alcanza su límite en isoterma, se observa un incremento de su nivel de sangrado que aumenta al alcanzar la MAOT (Maximum Allowable Operating Temperature).

Columna-1T1

El corte de los extremos no es una cuestión baladí

El posicionamiento de los extremos de la columna en el inyector y el detector resulta crítica para unas prestaciones óptima, y la forma del corte de los extremos afecta también a las prestaciones cromatográficas. Cada vez que tenga que efectuar un corte (mantenimiento de columna cambio de ferrulas o de precolumna…) use una lupa para comprobar que esté perfectamente a escuadra y sin residuos de ningún tipo.

Columna-3

En resumen, una columna se especificará por:

  1. Fase (5% Fenil Polisiloxano)
  2. Longitud (30, 60, 120m)
  3. Diámetro Interior (0.10, 0.18, 0.25, 0.32 mm)
  4. Espesor de Film (0.10, 0.15, 0.25, 0.50 μm)
  5. Temperatura Mínima de Servicio, Máxima en Isoterma y Máxima en programación (-60ºC, 320/350ºC)
  6. Si se ha testado en GCMS, tendrá el  sufijo MS (TraceGOLD TG-5MS)
  7. Código USP (G27)
Factores que alteran as prestaciones de la columna

La tabla siguiente muestra los factores más importantes a considerar:

Columna-1T

A. Longitud de la columna (L)

Doblar la longitud de la columna incrementa la resolución en ∼40%, pero se puede doblar el tiempo de retención

Columna 15m. Para el compuesto más retenido RT 4.3.
Columna 15m. Para el Dodecano RT 2.8.
Columna 30m. Para el compuesto más retenido RT 7.5
Columna 30m. Para el Dodecano RT 4.9

Los datos indican que doblando la longitud, para el Dodecano…

  • El Tiempo de Retención (RT) aumenta un 75%
  • El Número de Platos Teóricos (N) aumenta un 95%
  • La resolución (R) aumenta un 40%
B. Diámetro Interno (D.I.)

Disminuir el Diámetro Interno, no influye prácticamente en el Tiempo de Retención (RT), tiene un efecto ventajoso en la Resolución (R), pero disminuye la capacidad de carga  y la Relación de Fase (β)(1) de la columna…

Disminuir el D.I.
Disminuir el D.I. no influye en RT. RT Dodecano 4.9 con D.I. 0.25mm
Rt Dodecano
Rt Dodecano 4.3 con D.I. 0.32mm

Los datos indican que aumentando el Diámetro Interior, para el Dodecano…

  • El Tiempo de Retención (RT) disminuye un 12%
  • El Número de Platos Teóricos (N) disminuye un 14%
  • La resolución (R) disminuye un 13%
  • Sin embargo la Relación de Fase (β)(1) pasa de 250 a 320 que hace que la columna sea menos retentiva para compuestos de alto peso molecular
C. Espesor de Film

Un aumento del espesor de film acarrean un aumento de la retención, especialmente adecuada para compuestos volátiles (VOC’s), un aumento de la capacidad de carga, pero también el sangrado de la columna

Doblando el espesor de film aumenta mucho el RT. RT Dodecano 4.9
Doblando el espesor de film aumenta mucho el RT. RT Dodecano 4.9
Aumentando EF de 0.25um a 0.50 um RT dodecano casi dobla. RT 9.3
Aumentando EF de 0.25um a 0.50 um RT dodecano casi dobla. RT 9.3

Los datos indican que aumentando de 0.25 a 0.50 μm el Espesor de Film, para el Dodecano…

  • El Tiempo de Retención (RT) aumenta un 90%
  • El Número de Platos Teóricos (N) aumenta un 2%
  • La resolución (R) aumenta un 19%
  • Sin embargo la Relación de Fase (β)(1) pasa de 250 a 125 que hace que la columna sea mas retentiva y más adecuada para compuestos volátiles (COV’s)
D. La química de la Fase

En HRGC el principio en general es que los compuestos más polares requieren una fase más polar…

Columna-POL

Por lo tanto conocer qué grado de polaridad se requiere para obtener una separación satisfactoria con Tiempos de Retención razonables es una habilidad que se adquiere con la experiencia o con un conocimiento detallado la la polaridad y selectividad de cada fase.

¿Y los filtros de Gas?

El propósito de un filtro de gas es eliminar impurezas del gas portador que puedan dañar al instrumento o la columna cromatográfica.

El cromatograma siguiente muestra los beneficios del uso de un filtro de gas (de H2O, O2 y THC) si el portador no es de la pureza adecuada.

FILTROTRIPLE

(1). La Relación de Fase (β)

Con el valor de Relación de Fase (β),  se puede determinar qué columna resulta más adecuada para una determinada separación.

Cuanto menor sea β, mayor es la Relación de Fase frente al diámetro interno de la columna, haciendo que la columna sea más adecuada para la retención de compuestos volátiles.

Cuanto mayor sea β, menor es la Relación de Fase frente al diámetro interno de la columna, haciendo que la columna sea más adecuada para la retención de compuestos poco volátiles.

β=D.I. /4df

Donde:

  • β es la Relación de Fase
  • D.I. es el Diámetro Interior en μm
  • df es el Espesor de Film en μm

Dos columnas de igual longitud pero con el mismo β producirán cromatogramas similares-

 

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