Parte IV. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con IPA
Para más información vea también las Entradas siguientes:
- Parte I. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un Click. Descripción General
- Parte II. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. Test con Acetato de Etilo
- Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona
- Parte V. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en cualquier condición. Las Funciones Flash & Go, BOOST y ORM en detalle
El proceso de síntesis de una molécula, pasa por varias etapas (diseño del método, control de las condiciones, purificación del crudo…) y la que suele ser lenta y que, en general, no puede ser desatendida es el proceso de purificación del crudo.
Normalmente el técnico suele usar procedimientos estándar, que no siempre resultan los más eficientes en la obtención de un producto de alta pureza y con alto rendimiento.
De hecho el químico de síntesis frente a un crudo de reacción que ha de purificar se plantea las preguntas siguientes:
- ¿Qué combinación eluyente/fase estacionaria es la más adecuada?
- ¿Elución en Isocrático, por Etapas o por Gradiente?
- ¿Qué cantidad máxima de crudo no sobrecarga la columna?
- En mi CCF separo mis compuestos, ¿cómo transponer a Flash o LC-Prep?
En el primer caso una determinación preliminar se efectúa por CCF, normalmente en placas de SiO2, y un par de mezclas eluyentes estándar (Hexano/Heptano:Acetato de Etilo, Cloruro de Metileno:Metanol) casi siempre al 50%.
En el segundo se opta en general por una elución en condiciones isocráticas. Esta etapa es muy lenta, requiere la presencia física de un operador, y dista mucho de utilizar el método de separación más adecuado a las características únicas de la molécula sintetizada.
El tercero se basa en la experiencia de cada operador pero en general se tiende a sobredimensionar la columna con el consiguiente gasto de tiempo y material.
El cuarto caso ya ni se plantea y funciona mucho el método de «prueba y error».
1. Intersoft X® Genius: la solución
Intersoft X® Genius es un potente software dotado de Inteligencia Artificia que permite, mediante el análisis detallado de los resultados de una separación en CCF, seleccionar las condiciones más adecuadas (gradiente, columna) para obtener la mejor separación posible, ergo máxima pureza, en el tiempo más reducido posible, ergo costes mínimos de purificación tanto en tiempo como en materiales.
El Test de los 4 Compuestos (T4P)
Interchim ha diseñado un test específico para le verificación y puesta en marcha de sus equipos de purificación PuriFlash® que comprueba tanto el método de inyección, la eficacia en la generación del gradiente y la detección adecuada.
El test se compone de 4 productos de polaridad creciente (Naftaleno, 1-Nitronaftaleno, 2-Nitroanilina y 3-Nitroanilina) y de difícil resolución (2-Nitroanilina y 3-Nitroanilina) a una concentración determinada (50mg de cada). Ver Figura 1 y 2.
Dado que componentes del Test de los 4 Productos (T4P) no son especialmente solubles en las fases iniciales apolares (hexano, heptano, isooctano… etc) de un método de purificación en columna en condiciones de Fase Normal, han de ser depositados en un soporte inerte (Celite) y efectuar la inyección mediante el método de Carga Seca (Dry-Load).
El eluyente polar (B) más popular en Fase Normal es el Acetato de Etilo, pero su Cut Off de 256 nm obliga a usar λ de detección por encima de ese valor. Ver Figura 3.
Alcohol Isopropílico (IPA)
¿Por qué y cuándo utilizar el alcohol isopropílico (IPA)?
¿Por qué utilizar un eluyente de elevada fuerza como el alcohol isopropílico (IPA)? Aunque hay varias razones las dos principales son:
- Usar un eluyente transparente en toda la zona de scan entre 200 y 400 nm. La Acetona presenta una ventana entre 220 y 240nm y el Acetato de Etilo a partir de 256 nm.
- Valorar el cambio de selectividad al usar como eluyente un solvente localizado en el Grupo 2 (el Acetato de Etilo y la Acetona están en el Grupo 6), Para ver más detalles sobre el uso y selección de eluyentes en Purificación Flash vea Propiedades de los Solventes Usuales en HPLC.
Aunque los puntos anteriores son los más importantes también ha de tenerse en cuenta que:
- El Alcohol Isopropílico (IPA) tiene una Fuerza Eluyente muy superior (FE=0.59) y además pertenece al Grupo 2 por lo que puede resultar interesante su uso si los compuestos a detectar son transparentes por encima del cut off del eluyente polar o se busca una selectividad diferente.
- IPA se utiliza mucho como solvente intermedio si hay que pasar de Fase Normal a Fase Inversa y viceversa: es totalmente miscible con agua y con solventes apolares como el hexano.
La Figura 4 muestra que el uso de Alcohol Isopropílico (IPA) que es transparente en todo el rango de detección, permite la selección de λ de detección por debajo del cut off del Acetato de Etlo, permitiendo una mayor flexibilidad y selectividad.
Para comprobar la eficacia de Intersoft X® Genius en la generación de métodos la mezcla test se ha separado en CCF en las condiciones resultantes del análisis de las Placas TLC. Las condiciones óptimas de separación se consiguieron con mezclas binarias Hexano : IPA 95:05 y 90:10. Ver Figura 5.
- Hexano : IPA 95:05 (FE 0.039)
- Hexano : IPA 90:10 (FE 0.068)
- Hexano : IPA 85:15 (FE 0.097)
- Hexano : IPA 80:20 (FE 0.126).
Se puede utilizar el Gráfico de la Figura 6 ara calcular la FE e una mezcla binaria con eluyentes comunes Hexano como componente apolar (FE=0.01)
Lo resultados de estos ensayos se muestran en:
- Parte II. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. Test con Acetato de Etilo
- Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona
2. Intersoft X® Genius y «TLC to Flash & Prep»
La aplicación TLC to Flash & Prep permite en pasos muy simples transponer los datos obtenidos de una placa CCF y generar el mejor método Flash para la separación y purificación de los componentes de interés.
Tome una foto de su TLC con su Teléfono Inteligente o Tableta o seleccione de su librería la foto de una TLC anterior.
Sus compuestos se detectarán automáticamente o seleccione manualmente los de su interés con un simple toque.
La aplicación calcula los Rf y ΔCV (= ΔK). TLC to Flash & Prep indicará si los Rf están en la zona adecuada para efectuar su purificación (Zona de Confort)
A partir del menor ΔCV obtenido del análisis de su placa TLC, la aplicación indica el nivel de dificultad de la separación.
Indique los solventes usados y sus proporciones al efectuar su CCF y añada comentarios relevantes en las áreas correspondientes.
Guarde los datos de su placa TLC y envíela a un correo electrónico o a su puriFlash® mediante bluetooth o wifi: el software «Genius X« le recomendará el mejor método para una purificación con éxito.
3. TLC to Flash & Prep: Test 4 productos en Hexano:IPA 95:5
En las entradas correspondientes a las pruebas efectuadas con Acetato de Etilo (Test de Referencia a 80:20) y con Acetona se determinó que en el caso de la Acetona al ser su FE mayor que la del Acetato de Etilo se tenía que reducir su concentración con tal de eluir las placas de CCF con similar Fuerza Eluyente.
La Figura 5 muestra que con IPA sólo la 2-Nitro anilina y la 3-Nitroanilina tienen la retención suficiente en CCF de SiO2 para obtener Rf en la Zona de Confort (pese a que, estrictamente hablando, sólo la 2-nitroanilina está en la Zona de confort 0.1<Rf<0.4)
Por lo tanto se consideran TLC’s viables las obtenidas con C6:IPA 95:05 y 90.10. Ver Figura 6.
Durante el proceso de diseño del método «TLC to Flash & Prep» permite seleccionar qué compuestos son los de interés. La condición (aunque no necesaria) para que la transposición sea la más adecuada para obtener una resolución máxima y un tiempo de purificación mínimo es que los productos de interés eluyan en la «Zona de Confort (0.4>Rf>0.08)». La Zona de Confort se indica con un marco de color amarillo.
3.1. C6:IPA 95:05. Selección de los compuestos peor resueltos y en la Zona de Confort (Compuestos 3 y 4)
En las condiciones propuestas (C6:IPA 95:05 FE=0.039) los productos que tienen mayor retención (3-Nitroanilina y 2-Nitroanilina) eluyen cerca del límite inferior de la zona de confort. Más adelante se efectuará el mismo procedimiento con una mezcla eluyente de mayor fuerza (C6:IPA 90:10 FE=0.068).
Los Rf son, respectivamente 0.12 y 0.21 para 3-Nitroanilina y 2-Nitroanilina, y su DCV de 3.93 valor indicativo de una separación difícil.
Al transmitir los datos obtenidos en «TLC to Flash & Prep» (ver Figura 6) al software Genius X® de un equipo PuriFlash® tras aceptar la recepción, se muestra en la primera pantalla una representación comprimida de la Placa de Capa Fina (TLC) con los productos seleccionados y una serie de columnas propuestas para la purificación. El software pedirá también detalles de la solubilidad de los productos en la fase móvil inicial y, si fueran insolubles, permitirá seleccionar también el tamaño de cartucho de carga seca (Dry Load) necesario. Ver Figura 7.
En este caso, al ser necesario un gradiente inicial de poca FE sería necesaria una concentración muy baja de IPA, y, para garantizar que el gradiente propuesto sea lo más preciso y reproducible posible, Genius X® propone el uso deuna pre-mezcla de C6:IPA al 88:12 como eluyente B que se indicará como Pre-Mix (ver rectángulo rojo)
La siguiente pantalla muestra el Método Generado a falta de otros detalles como las longitudes de onda de detección de pico, de registro y de Scan, del umbral de detección y método de parada y del nombre del Método y de la Muestra. La figura 8 muestra un resumen de las pantallas principales.
¿Por qué Genius X® selecciona una pre-mezcla en este caso particular?
Si consideramos el gradiente propuesto con Pre-Mezcla (ver Figura 8), ¿es posible generar un gradiente preciso que genere la misma FE pero sin pre-mezcla?
La Figura 9 muestra el gradiente efectivo generado via Pre-Mezcla (registro azul), el % B real (registro rojo) de y la fuerza eluyente efectiva (registro verde). Ver también la Tabla 1.
La Figura 9 y la Tabla 1, muestran que, para obtener una FE adecuada con eluyente de elevada Fuerza Eluyente (IPA=0.59) es necesario o operar con gradientes que requieren muy bajos porcentajes del eluyente más polar (B).
Para una FE como la calculada en la Tabla 1 (Columna FE), resulta necesario 1.08% de B (0.48% B en el caso de selección de los cuatro componentes de T4P) para obtener la misma FE que se obtiene con 9% de Pre-Mezcla 88:12 C6:IPA (4% de Pre-Mezcla en el caso de selección de los cuatro componentes de T4P).
La IA de Genius X propone una Pre-Mezcla para generar un gradiente más preciso y reproducible teniendo en cuenta que el Volumen Muerto de un sistema Flash o LC-Prep es mucho mayor que el de un sistema HPLC analítico. Ver Figura 10.
El Resultado de la Purificación al seleccionar el par poco resuelto corresponde a la Figura 11.
3.2. C6:IPA 95:05. Selección de todos los compuestos (Compuestos 1, 2, 3 y 4)
En este caso Genius X propone un gradiente ligeramente distinto al tener en cuenta tanto los productos de poca retención como los más retenidos.
Como en el caso anterior, al ser necesario un gradiente inicial de poca FE sería necesaria una concentración muy baja de IPA, y, para garantizar que el gradiente propuesto sea lo más preciso y reproducible posible, Genius X® propone una pre-mezcla de C6:IPA al 88:12 como eluyente B que se indicará como Pre-Mix (ver rectángulo rojo)
La figura 13 muestra un resumen de las pantallas principales y el Método Generado a falta de otros detalles como las longitudes de onda de detección de pico, de registro y de Scan, del umbral de detección y método de parada y del nombre del Método y de la Muestra.
El Resultado de la Purificación al seleccionar el par poco resuelto corresponde a la Figura 14.
La Tabla 2 muestra los Valores de Rs y α para los dos casos anteriores (TLC con una mezcla binaria C6:IPA 95:05) y los equivalentes con C6:IPA 90:10 que se verán más adelante. Tanto en el primer caso de menor FE como en el segundo, de mayor FE, los valores de Rs y α son excelentes
3.3. C6:IPA 90:10. Selección de los compuestos peor resueltos y en la Zona de Confort (Compuestos 3 y 4)
Con una mezcla eluyente de mayor fuerza (C6:IPA 90:10 FE=0.06) los Rf son, respectivamente 0.20 y 0.31 para 3-Nitroanilina y 2-Nitroanilina, y su ΔCV de 1.90 indica una separación más fácil que en el caso anterior (95:05).
En estas condiciones siguen estando fuera de confort los compuestos menos retenidos (Naftaleno Rf 0.70, 1-Nitronaftaleno Rf 0.52).
El método propuesto por Genius X® (ver Figura 16) ya no requiere una premezcla previa para garantizar un gradiente preciso.
La Figura 17 muestra la FE resultante del Método generado según las condiciones anteriores y comparándola con la FE producida con el Método generado de la Separación TLC de T4P con C6:IPA 95:05.
El Resultado de la Purificación al seleccionar el par poco resuelto corresponde a la Figura 18.
3.4. C6:IPA 90:10. Selección de todos los compuestos (Compuestos 1, 2, 3 y 4)
Las placas TLC generadas se muestran en la Figura 15 anterior.
En estas condiciones siguen estando fuera de confort los compuestos menos retenidos (Naftaleno Rf 0.70, 1-Nitronaftaleno Rf 0.52).
El método propuesto por Genius X® (ver Figura 19) ya no requiere una pre-mezcla previa para garantizar un gradiente preciso.
La Figura 17 muestra la variación de FE según el gradiente anterior propuesto por Genius X . En este caso selección de todos los componentes de T4P (registro azul).
La Figura 20 muestra el resultado de la purificación según el método automático propuesto.
En la Tabla 2 (ver apartado anterior) se indican los valores de Rs para los compuestos peor resueltos (P3 y P4) y los resultados obtenidos, excelentes en cualquier caso (purezas superiores al 99,5%, Rs>1.5).
Conclusiones
- Genius X® permite obtener resultados óptimos con las mismas TLC’s usadas para el seguimiento de reacciones o comprobación de la pureza de los productos sintetizados.
- La IA de Genius X® permite optimizar las separaciones en función de las necesidades del usuario (mayor velocidad, mayor pureza) sin la necesidad de complicados cálculos previos y se adapta a las características de la Fase Estacionaria y Geometría de Columna de las columnas disponibles.
- Una condición importante es que los productos seleccionados estén en la Zona de Confort (los productos de interés han de eluir en CCF entre los valores de Rf comprendidos entre 0.1 y 0.4 (0.1<Rf<0.4)). En este caso las condiciones de Fuerza Eluyente pueden modificarse tanto para acelerar el proceso de purificación por UPFC (aumento de FE) como para incrementar la separación de un par con Rf muy próximos (disminución de FE).
- Los ejemplos anteriores se basan en condiciones operativas muy usuales en purificaciones en Fase Normal (Hexano y Acetato de Etilo), pero si el usuario prefiere utilizar otros eluyentes, para tener otras ventanas de detección, por ejemplo, Genius X recalcula las condiciones operativas para obtener los mejores resultados en cada caso. Ver Parte II. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. Test con Acetato de Etilo y Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona
- Con Intersoft X® Genius, no se requieren conocimientos especiales de Cromatografía. ¡Cualquier técnico puede obtener excelentes resultados en su primer intento de purificación desde una adecuada separación previa por CCF!
Para más información vea las Entradas siguientes:
- Parte I. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un Click. Descripción General
- Parte II. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. Test con Acetato de Etilo
- Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona
- Parte IV. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con IPA
- Parte V. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en cualquier condición. Las Funciones Flash & Go, BOOST y ORM en detalle