Lipika Basumallick and Jeffrey S. Rohrer. Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA

Introducción

Los biocombustibles se aceptan ampliamente hoy como una alternativa a los combustibles fósiles^1,2. Actualmente se producen biocombustibles procedentes de la biomasa generada por el maíz y la caña de azúcar. Otra fuente prometedora es la madera, especialmente porque es una fuente no alimentaria. Si se compara con el maíz y otras fuentes de alimentos, la obtención de biocombustibles la madera resulta más sostenible. La madera tiene otras ventajas inherentes: los árboles requieren menos riego y fertilizantes y pueden ser cosechados a lo largo del año. El combustible obtenido de madera se espera que sea una alternativa comercial competitiva hacia 2020³.

La determinación de carbohidratos en hidrolizados de madera resulta de crucial importancia durante la producción de biocombustible. La degradación de la lignina y celulosa de la madera en carbohidratos fermentables se controla para maximizar la eficacia de la conversión Biomasa/Combustible, y está directamente relacionada con el rendimiento de la producción de etanol. La cromatografía líquida, inclusive la de intercambio aniónico de altas prestaciones con Detección Amperométrica Pulsante (HPAE-PAD), se puede usar para la determinación de carbohidratos en el hidrolizado ácidos de la madera^4,5.

HPAE-PAD ha demostrado ofrecer determinaciones rápidas de carbohidratos en muestras derivadas de plantas usando la columna Thermo Scientific™ Dionex™ CarboPac™ SA10.^6,7

La determinación de carbohidratos en el hidrolizado ácido de muestras de rastrojo de maíz con una dilución de 100:1 se ha mostrado en la Nota de Aplicacion 286 de Thermo Scientific.⁶

El método usa un eluyente hidróxido generado electrolíticamente y una camisa de 15 mil (en lugar de la estándar de 2 mil) en la celda electroquímica para resolver los azúcares comunes de la biomasa (xilosa, sucrosa, arabinosa, galactosa, glucosa, mannosa, y fructosa) en menos de 8 minutos. Más recientemente se han aplicado dos modificaciones de hardware en la Actualización de Aplicación (AU) 192 de  Thermo Scientific, para una manipulación más fácil de las muestras de alta concentración:

• El volumen de inyección se ha reducido de 10 a 0.4 μL.
• El espesor de la camisa se ha aumentado 62 mil en la celda electroquímica para reducir la sensibilidad.⁷

Gracias al mayor rango lineal del método modificado los carbohidratos presentes en un hidrolizado ácido de rastrojos de maíz pueden determinarse con una dilución de 1:10 en lugar de la mayor dilución (o diluciones múltiples) requeridas con la camisa 15 mil.

En este trabajo se desarrollan métodos para la determinación de carbohidratos de madera con la nueva columna Dionex CarboPac SA10-4μm, siguiendo las modificaciones antes comentadas. Esta versión de la columna (de menor tamaño de partícula de resina) permite separaciones de alta resolución y eficacia, especialmente para el par rmannosa-galactosa, difíciles de separar con los métodos actuales. Como se esperaba, las partículas más pequeñas generan una mayor contrapresión en comparación con la generada por la columna tradicional Dionex CarboPac SA10. Por lo tanto la columna Dionex CarboPac SA10-4μm ha de configurarse con el nuevo sistema Thermo Scientific™ Dionex™ ICS-5000+ HPIC™ , que permite Cromatografía Iónica (IC) de alta presión.

Los parámetros de prestación del método (precisión, exactitud y linealidad) demuestran que los métodos descritos son rápidos, ofrecen una buena sensibilidad y respuesta consistente y pueden usarse en rutina para la determinación de azúcares en muestras de madera.

Objetivo

Determinar los carbohidratos individuales en hidrolizados ácidos de madera usando una columna con partículas de resina de menor tamaño que las de la columna estándar para obtener separaciones de alta resolución de azúcares especialmente de los pares difíciles de separar con los métodos tradicionales.

Instrumentación

• Sistema Dionex ICS-5000+ HPIC que incluye:
  • SP Single Pump oDP Dual Pump con el kit de conversión de desgasificadoswith  (P/N 063353) instalado*
  • DC Compartimiento Detector/Cromatiografía
  • Kit de Reconstrucción para válvula de 4-puertos (P/N 074699), que incluye un bucle de inyección de 0.4 μL
  • ED Detector Electroquímico (sin celda P/N 072042)
  • Celda Electroquímica con Elñectrodo de Referencia  (P/N AAA-061756)
  • Electrodo desechable Oro en Politetrafluoroetileno (PTFE) (P/N 066480)
  • Electrodo de Referencia pH, Ag/AgCl (P/N 061879)
  • Kit de Análisis de Carbohidratos de Alta Concentración (con camisa de  62 mil PTFE y bloque separador  modificado P/N 085324)
• Inyector Automático Thermo Scientific Dionex AS-AP Autosampler
• Software Thermo Scientific™ Dionex™ Chromeleon™ Chromatography Data System (CDS) software

* Ver Instrucciones de Instalación de  Dionex ICS-3000 EG Vacuum Degas Conversion Kit (Document No. 065067) para más información

Consumibles

• Kit de Viales, 0.3 mL Polypropylene con Tapón y Septa (P/N 055428)
• Filtros de Cultivo Deechables Estériles Nalgene™ MF75™ Series, 1000 mL, 0.2 μm (Fisher Scientific P/N 09-740-46)
• Cartucho Generador de Eluyebte Thermo Scientific Dionex EGC III KOH
• Columna Aniónica Trampa de Regeneración Contínua Thermo Scientific Dionex CR-ATC

Reactivos y Estándares

Reactivos

Agua Desionizada  (DI), Grado Tipo I , 18 MW-cm o mejor, filtrada por un filtro de 0.2 μm inmediatamente antes de su uso.

Estándares

• L(–)-Fucosa (Fisher Scientific P/N AC22588-0010)
• D-Galactosa (Fisher Scientific P/N S25334)
• D(+)-Mannosa (Fisher Scientific P/N AC15060-1000)
• D-Fructosa (Fisher Scientific P/N L96-500)
• D-Xilosa (Fisher Scientific P/N X9-25)
• Sucrosa (Fisher Scientific P/N S5500)
• D-Glucosa (Fisher Scientific P/N D16-1)
• D-Arabinosa (Fisher Scientific P/N S25650)
• D(+)-Cellobiosa (Fisher Scientific P/N AC108460250)

Preparación de Soluciones y Reactivos

Eluyente Hidróxido de Potasio, 1 mM

Genere el eluyente KOH on line bombeando agua des-ionizada y des-gasificada  de alta calidad a través del Cartucho Generador de Eluyente KOH Dionex EGC III KOH. El software Chromeleon CDS controla la cantidad de KOH usado y calcula la vida restante del cartucho. Aunque los eluyentes pueden prepararse manualmente si fuera necesario, resulta más conveniente en esta aplicación usar eluyentes creados por un generador. El uso de eluyentes preparados manualmente no se recomienda al no poderse garantizar las prestaciones del método. La preparación consistente de un eluyente hidróxido 1 mM o 10 mM resulta difícil debido la contaminación variable por carbonato. El impacto de este tipo de contaminación es significativa a bajas concentraciones de hidróxido. Si se han de preparar manualmente use NaOH en lugar de KOH, y prepárelos según las instrucciones generales de la Nota Técnica Dionex 71⁸. En esta aplicación la generación electrolítica del eluyente produce unas prestaciones superiores.

Soluciones Madre de Estándares

Disuelva los estándares sólidos en agua DI a una concentración de 200 mg/L de cada carbohidrato. Mantenga la solución madre a -20ºC hasta su uso.

Soluciones de Trabajo de Estándares

Prepare las soluciones de trabajo en agua DI diluyendo las soluciones madre. Almacene las soluciones  a 4ºC. Haga las diluciones gravimétricamente para asegurar una elevada precisión. Las concentraciones necesarias para la calibración deberán estar en el rango de 0.05 to 2.4 g/L (0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0, 1.6, 2.0, y 2.4 g/L).

Preparación de la Muestra

Hidrolizados Ácidos de Madera

Las muestras fueron donadas por el National Renewable Energy Laboratory en Golden, Colorado. El licor usado en este estudio contenían un 1% de ácido sulfúrico. Las muestras de licor se centrifugaron (tanto el licor como el lixiviado de pino torcido) a 16,000 g durante 10 min para asegurar la eliminación de partículas, y se inyectaron diluidas 1:2 o 1:50 en agua DI para su análisis.

Precauciones

Se observó inicialmente una contaminación cruzada porque las muestras de biomasa tratada tenían altas concentraciones de azúcares como xilosa, glucosa y galactosa. Un lavado de la jeringa con  500 μL de agua DI reduce la contaminación y se recomienda el lavado entre muestras. Un  lavado de columna con 100 mM KOH durante 20 min se recomienda si se observa una deriva de los tiempos de retención (RT). En general se recomienda el lavado de la columna cada cinco o seis días (~300 inyecciones) para mantener los RT y las áreas de los picos con RSD<8%. La aplicación de 100 mM KOH cambia el equilibrio del sistema y, por lo tanto, es necesario un re-equilibrado a 1 mM durante 30 min tras el lavado de columna para conseguir una alta precisión. Substituya el electrodo de referencia cada seis meses y los electrodos desechables cada cuatro semanas.

Resultados y Discusion

Separación

Los carbohidratos de interés en hidrolizados ácidos de madera son fucosa, sucrosa, arabinosa, galactosa, ramnosa, glucosa, xilosa, mannosa, fructosa, cellobiosa y maltosa. La Figura 1 compara la separación de esos carbohidratos en la columna estándar Dionex CarboPac SA10 de 6 μm y la nueva versión de  4 μm siguiendo el Método 1 ( (caudal 1.5 mL/min y temperatura de columna 45 °C). El formato 4 μm permite separaciones muy eficientes y mejores relaciones señal/ruido  (S/Ns) que la columna estándar. El menor tamaño de partículas genera una mayor contra-presión y se utiliza un sistema Dionex ICS-5000+ HPIC que permite presiones de hasta 5000 psi. Aunque el tiempo de análisis es similar en ambas columnas, las eficacias de pico se  mejoran en >40%   con la columna de 4 μm, que permite una mayor resolución y un superior S/N.

La Figura 2 presenta la determinación de carbohidratos en dos hidrolizados de madera (un licor y un lixiviado). Las muestras se analizaron tras una dilución de 2 a 50 veces y contenía principalmente arabinosa, glucosa, xilosa, y mannosa. El tiempo total de análisis fue de 14 min. En estas condiciones, sin embargo, la galactosa y la ramnosa coeluyen.

El par galactosa-ramnosa se pueden resolver bajando la temperatura a to 30 °C. La contra-presión se incrementa al bajar la temperatura, y el caudal ha de bajarse a 1.e mL/min. En estas condiciones (Método 2), se separan 11 azúcares de madera como muestra la  Figura 3. Este cromatograma muestra separaciones en ambas versiones de columna Dionex CarboPac SA10  y, como se espera, la columna de  4 μm ofrece una mayor resolución que la columna de 6 μm. Bajo estas condiciones, sin embargo, los pares sucrosa/arabinosa y fructosa/mannosa no se resuelven.

Por lo tanto se proponen dos métodos: el Método 1 para todos los azúcares de madera excepto la ramnosa, y el Método 2 para muestras en que se espera la presencia de ramnosa.

La Figura 4 muestra la presencia 0.14 g/L (corregida por la dilución) de ramnosa en una muestra de licor de madera.

Nota: La prestación cromatográfica no resulta afectada por la presencia de altas concentraciones de sulfatos en las muestras de hidrolizado ácido. La neutralización o eliminación del sulfato no es necesaria antes de la inyección.  La concentración de ácido en las muestras es típicamente ~70% durante las primeras etapas de la hidrólisos y de ~1–4% en las etapas finales⁴. Diluya las muestra entre 2 y 50 veces para esta aplicación.

Precisión

La precisión de un procedimiento analítico se expresa típicamente como la RSD de una serie de medidas. Para ambos métodos se determinaron las precisiones para el área del pico y RT en seis inyecciones repetidas de una mezcla de estándares de azúcares (Tabla 1).

La concentración utilizada para el cálculo de la precisión fue de 1.0mg/mL para cada uno de los azúcares.  La precisión (RSD) para RT fue <0.3 y las precisiones para el área de pico variaron entre 2.0 y 3.4. Las RSD en RT y área de pico fueron entre <0.5 y 1-3.8, respectivamente. Las elevadas precisiones en RT se pueden atribuir a la consistente generación de KOH de alta pureza producida por el generador de eluyente. Con fases móviles preparadas manualmente los RSD, especialmente la de RT, serán ciertamente superiores  a los obtenidas con el generador de fase móvil.

Rango lineal

En varios hidrolizados ácidos de madera se constató que los azúcares presentes tenían un rango de concentración de 50 a 100g/L, mientras que los componentes minoritarios estaban en el rango entre 0.1 y 10 g/L. (Tabla 2).

Con el método modificado sugerido en AU192 (menor volumen de muestra y un electrodo con camisa más gruesa), las muestras pueden analizarse tras una dilución de 2-, 10-, o 50 veces. La linealidad con el Método 1 se determinó inyectando estándares por triplicado con rangos entre 0.05 y 2.4 g/L. Los azúcares fueron lineares con coeficientes  para la determinación entre  .9980 y 0.9998. Se obtiene una  linealidad similar con el Método 2 (no mostrada).

Precision

La precisión del método se verificó determinando las recuperaciones de azúcares de muestras de hidrolizados ácidos de maderas dopadas (la Muestra 1 era un lixiviado y la Muestra 2 un licor) a lo largo de tres días consecutivos (Tabla 3).

La sucrosa no es estable en estos hidrolizados ácidos al hidrolizarse a glucosa y fructosa (datos no mostrados). las muestras se enfriaron antes del dopado en inyectadas inmediatamente para su análisis.

Nota: Si se usa una solución de dopado que contenga una mezcla de azúcares no añada sucrosa a la solución puesto que falseará los resultados para la glucosa y la fructosa

Las muestras se doparon para obtener una concentración adicional de 0.4g/L para cada azúcar. Las recuperaciones se calcularon por la diferencia de respuesta entre  las muestras dopadas y no dopadas. Las recuperaciones medias de los azúcares en ambos métodos oscilaron entre el 71 y 103%, lo que indica que estos métodos son precisos para determinar los azúcares de interés  en esta mezclas complejas de hidrolizados ácidos.

Reproducibilidad de la Columna

Par determinar la reproducibilidad de la columna se evaluaron tres diferentes columnas de tres lotes  de producción distintos.  Los valores de RSD para la eficacia de  la arabinosa, para la resolución entre xilosa y manosa con inyección de mezclas a 1 g/L fueros <5%.

Conclusión

Este estudio describe dos métodos rápidos y robustos para la determinación precisa por HPAE-PAD de azúcares comunes en muestras de hidrolizados ácidos de madera. Ambos métodos usan la columna Dionex CarboPac SA10-4μm con un  generador electroquímico de eluyente hidróxido, un volumen de muestra reducido y una camisa más gruesa del electrodo de trabajo. El menor tamaño de partícula usado en las columnas de 4 μm permiten separaciones de mayor eficacia que las columnas estándar. En particular el Método 2 permite una mejor separación de la galactosa que la columna estándar de 6 μm.

Referencias

1. Larsen, E. Biofuel Production Technologies: Status, Prospects and Implications for Trade and Development, Presented at the United Nations Conference on Trade and Development, Geneva, Switzerland, 2008 [Online] www.unctad.org/en/docs/ ditcted200710_en.pdf (accessed March 12, 2014).
2. Demirbas, A. Biofuels: Securing the Planet’s Future Energy Needs; Springer: New York, 2009; pp 1–336.
3. Stephen, J.D.; Mabee, W.E.; Saddler, J.N. Will Second-Generation Ethanol Be Able to Compete with First-Generation Ethanol? Opportunities for Cost Reduction. Biofuels, Bioproducts and Biorefining 2012, 6 (2), 159–176.
4. Sluiter, J.B.; Ruiz, R.O.; Scarlata, C.J.; Sluiter, A.D.; Templeton, D.W. Compositional Analysis of Lignocellulosic Feedstocks. 1. Review and Description of Methods. J. Agric. Food Chem. 2010, 58 (16), 9043–9053.
5. Davis, M.W. A Rapid Modified Method for Compositional Carbohydrate Analysis of Lignocellulosics by High pH Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAEC/PAD). J. Wood Chem. Technol. 1998, 18 (2), 235–252.
6. Thermo Scientific Application Note 282: Rapid and Sensitive Determination of Biofuel Sugars by Ion Chromatography. Sunnyvale, CA, 2012. [Online] www.dionex.com/en-us/webdocs/113489-AN282-ICBiofuel- Sugars-03May2012-LPN2876-R2.pdf (accessed March 12, 2014).
7. Thermo Scientific Application Update 192: Carbohydrate Determination of Biofuel Samples. Sunnyvale, CA, 2014. [Online] www.dionex.com/ en-us/webdocs/115024-AU192-IC-Carbohyrdrates- Biofuels-AU70789_E.pdf (accessed March 12, 2014).
8. Thermo Scientific Technical Note 71: Eluent Preparation for High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. Sunnyvale, CA, 2013. [Online] www.dionex.com/en-us/webdocs/58087-TN71- HPAE-PAD-Eluent-Prep-TN70669_E.pdf (accessed March 12, 2014).