Introducción a la Caracterización de Anticuerpos Monoclonales (mAb)
Los productos biofarmacéuticos basados en proteínas y anticuerpos monoclonales (mAb), representan una gran parte del creciente mercado de drogas biológicas, y han transformado la industria botecnológica y biofarmacéutica en la última década. El tratamiento con mAb es uno de los métodos más efectivos para el tratamiento y diagnosis de enfermedades, inclusive los desórdenes autoinmunes, enfermedades cardiovasculares, cáncer e inflamación. La Tabla 1 muestra las definiciones de los términos usados comúnmente.
Hay una extensa línea de desarrollo de terapias basadas en proteínas y mAb, que hace hincapié en la necesidad de herramientas analíticas innovadoras y eficientes. Durante el desarrollo y producción de esos productos resulta esencial detectar, caracterizar y cuantificar variantes estructurales y modificaciones y controlar la estabilidad del producto, claves para demostrar la seguridad y eficacia y requeridas por la FDA, EMA, CFDA y otras agencias reguladoras.En la Tabla 2 se muestran los varios métodos analíticos por LC y LC-MS usados en el control de productos biológicos, además de las columnas y tampones recomendados.
Los anticuerpos monoclonales tienen estructura muy compleja con muchas posibles variaciones posicionalmente específicas. Con un potencial tan grande para modificaciones post translacionales (PTM’s) resulta muy complicados el control de calidad y estabilidad de los mAb’s.
La cromatografía de líquidos de alta presión se ha establecido como una herramienta esencial en la caracterización de mAbs y otras proteínas bioterapéuticas.
Flujos de trabajo en Biofarma
Control de rutina y selección de clones
En una etapa temprana de purificación, la primera etapa normalmente es la purificación de mAb o lgG de obtenidos en cultivos de fluidos celulares (HCCF) con Proteína A. A menudo sigue una etapa de Cromatografía de Exclusión (SEC) para el perfilado de agregados y Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC) para el análisis de variantes de carga. Estos procesos de separación, por lo tanto, ocupan la mayor parte de los análisis efectuados durante el desarrollo de mAb.
Perfilado de mAb Intactos y Análisis de Subunidades
El análisis de mAb intactos ofrece información sobre el peso molecular, relación droga-anticuerpo (DAR) y perfiles de glicanos. El análisis de fragmentos de mAb puede indicar rápidamente la localización de las modificaciones sin requerir la digestión completa del mAb. Las cadenas ligeras de mAb (LC) y las pesadas (HC) se generan por reducción de los cuatro enlaces internos disulfuro. La papaína escinde por encima de la región bisagra que contienen los enlaces disulfuro que unen las cadenas pesadas, pero por debajo de la región de los enlaces disulfuro entre la cadena ligera y la pesada, generando dos fragmentos de mAb y un fragmento Fc intacto. La enzima que degrada la inmunoglobulina de Streptococcus pyogenes es una proteasa altamente específica que escinde la Inmunoglobulina G (lgG) en un solo sitio por debajo de la región bisagra produciendo una cadena única Fc (scFc) y fragmentos F(ab’)2 (enfoque middle-down). Mediante fragmentaciones múltiples (MSn) se puede analizar en profundidad variantes y secuencias.
Mapa de Péptidos de Alta Resolución
Se obtiene un análisis a fondo de la secuencia mAb por digestión con tripsina y análisis de los péptidos trípticos por LC -MS / MS y separación de fase inversa C18. El mapeo de péptidos se utiliza generalmente para identificar las modificaciones de aminoácidos como la deaminación y la oxidación. El análisis estructural se efectúa mediante espectrometría de masas de alta resolución durante la etapa de desarrollo. Sin embargo para control de calidad de rutina, las separaciones de péptidos se controlan por UV.
Análisis de Glicanos
El diagrama de flujo de trabajo muestra las vias más comunes para analizar estructuras de glicanos y zonas glicosiladas. PNGase F es una endoglicosidasa que corta el enlace entre la asparagina y N-acetilglucosaminas. Tras la digestión PNGase F, se separan los carbohidratos N-unidos del mAb y se analizan tanto por métodos IC o HPLC. Para la identificación de los sitios glicosilados se utiliza en general una digestión tríptica y los los glicopeptidos se analizan por LC-MS. Para control de calidad de los productos biológicos los mAb intactos se utiliza un espectrómetro de masas de alta resolución para obtener el peso molecular exacto e información sobre el perfil de glicanos.
La solución completa
La combinación de los flujos de trabajo anteriores permite que los usuarios alcancen un amplio rango de objetivos analíticos, como:
- Análisis de concentración y pureza
- Análisis de agregados
- Análisis de variantes de carga
- Escisiones y cortes
- Análisis de cadenas ligeras y pesadas
- Mapa de péptidos
- Perfil de glicanos
- Análisis de modificaciones post-translacionales (substitucione/recorte de aminoácidos, deamidación, fosforilación…
Thermo Fisher Scientific ofrece una solución completa para cada uno de los flujos de trabajo, permitiendo que los científicos obtengan resultados óptimos y fiables.
Más Información
Visite las siguientes entradas si desea más información sobre las nuevas columnas para biocromatografía de Thermo Scientific:
- Determinación de la Concentración de mAb por Cromatografía de Afinidad)
- Separación de Agregados por Cromatografía de Exclusión (SEC)
- Análisis de Variantes de Carga por Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC)
- Análisis de Variantes por Oxidación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)
- Análisis de Conjugados Anticuerpo-Droga (ADC) por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) y de Fase Inversa (RP)
- Análisis de mAB’s Intactos y Fragmentos de mAb’s por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
- Mapa de Péptidos por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
- Análisis de Glicanos por Cromatografía de Modo Mixto (MMC) y Cromatografía de Interacción Hidrofílica (HILIC)
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