Introducción

El principal objetivo en el desarrollo de una separación cromatográfica es la resolución de una mezcla de analitos. Analizando la representación gráfica de la Ecuación General de Resolución, ver Figura 1, resulta evidente que el Parámetro de Selectividad, a, produce el mayor impacto en la resolución.

La selectividad puede modificarse cambiando la composición de la fase móvil, de la química de la columna o la temperatura.

Para caracterizar completamente la química de superficie de los materiales de fase inversa se utilizan una serie de comprobaciones cromatográfica basados en los Tests de Tanaka, para permitir el análisis de las interacciones entre el analito y la fase estacionaria, la medida de la hidrofobicidad, la selectividad por forma, el enlace de hidrógeno e interacciones secundarias con bases, ácidos y quelantes:

• Retención Hidrofóbica (HR)
  El factor de capacidad k de un hidrocarburo neutro como el pentilbenceno indica la hidrofobicidad de la fase estacionaria y, consiguientemente, una medida de la carga de carbono de la sílice
• Selectividad Hidrofóbica (HS)
  El factor de selectividad entre el pentilbenceno y el butilbenceno indica una medida del recubrimiento de la fase: estos dos alquilbencenos difieren únicamente por un grupo metilénico y su selectividad depende de la densidad del ligando.
• Selectividad Estérica (SS)
  El test se basa en la relación de K entre o-Terfenilo y el Trifenileno. Ambos compuestos tienen el mismo tamaño molecular pero difieren fuertemente en su disposición espacial: el Trifenileno es planar y el o-Terfenilo presenta un anillo fuera del plano. En general las columnas de enlace polimérico muestran un mayor grado de electividad estérica que sus equivalentes de enlace monomérico
• Enlace de Hidrógeno (HBC)
  La capacidad de crear enlaces de hidrógeno (HBC) de la fase estacionaria se mide determinando el factor de selectividad entre la cafeína y el fenol que indica el número de grupos silanoles libres y el nivel de bloqueo (End Capping). Un valor bajo indica un bajo nivel de silanoles disponibles para crear enlaces de hidrógeno y una buena eficacia del bloqueo.
• Capacidad de Intercambio Iónico a pH 2.7 (IEXC2.7)
  Tanaka ha mostrado que la retención de aminas protonadas a pH<3 puede ser indicativa de la medida de los sitios de intercambio iónico en la superficie de la sílice. A este pH los grupos silanoles (Si-OH) no están disociados y no contribuyen a la retención de aminas protonadas, pero los silanoles libres ácidos en su forma disociada (Si-O^–) sí pueden interaccionar. El factor de selectividad entre el fenol y la bencilamina a pH 2.7 es indicativo de la contribución de los silanoles libres a los cambios de retención.
• Capacidad de Intercambio Iónico a pH 7.6 (IEXC7.6)
  El factor de selectividad entre la bencilamina y el fenol indica la actividad total de los silanoles de la sílice. A pH>7 los silanoles están disociados y se suman a los sitios de intercambio iónico para modificar la retención de la bencilamina.
• Actividad frente a Compuestos Básicos (BA)
  La presencia de silanoles disociados a pH>7 provoca mediocres formas de pico de compuestos básicos protonados como la amitriptilina. Las interacciones secundarias de intercambio iónico y las causadas por los silanoles pueden causar cambios en los tiempos de retención y picos asimétricos. El factor de capacidad y el valor de la asimetría del pico de la amitriptilina son indicativos de la prestación general de la columna.
• Compuestos Quelantes (C)
  Las interacciones superficiales con los metales presentes en la sílice pueden provocar cambios en la selectividad o en la forma de pico de los compuestos quelantes como la quinizarina: cambios en el factor de capacidad y el valor de la asimetría del pico indican interacciones secundarias con las impurezas metálicas de la sílice.
• Interacciones con Compuestos Ácidos (AI)
  La inercia de la fase estacionaria frente los compuestos ácidos resulta muy importante puesto que estas especies pueden resultar adsorbidas en los materiales de fase reversa. El factor de capacidad y el valor de la asimetría del pico del ácido clorocinnámico indican la actividad de la fase frente a compuestos ácidos.

Los datos de caracterización se resumen en Gráficos Radar o Diagramas de Araña. En cada eje se registran los valores de cada categoría, el centro es el valor cero y el mayor traza el punto más periférico.

Selectividad de la Gama de Fases Inversas Accucore 2.6 μm

Las columnas Accucore utilizan la tecnología CET (Core Enhanced Technology) para facilitar separaciones rápidas y de alta eficacia. Las partículas de 2.6 μm tienen un núcleo sólido y una capa porosa externa con partículas de tamano y porosidad estrictamente controladas para garantizar una menor pérdida de carga que la generada por las fases porosas tradicionales. El uso, además de sílice de alta pureza y sistemas de enlace optimizados permiten crear fases de muy alto recubrimiento y extraordinaria robustez.

Las columnas Accucore se suministran en varias químicas para ofrecer una amplia gama de selectividades en Fase Inversa y facilitar el desarrollo de métodos:

• Cadenas alquílicas optimizadas (RP-MS)
• C18
• C8
• C18 con Bloqueo Polar (aQ)
• Fenil-Hexil
• Pentafluorofenil (PFP)

La Retención Hidrofóbica (HR) y la Selectividad Hidrofóbica (HS) de C18, RP-MS y aQ son similares y mayores que las de las fases aQ y Fenil-Hexil. La Selectividad Estérica (SS) de la fase aQ es ligeramente mayor que C18 y RP-MS pero mucho menor que la fase PFP en la que los grupos flúor causan una gran selectividad en isómeros posicionales de compuestos halogenados. La fase fenil-hexil ofrece un modo mixto, siendo la cadena C6 responsable de las interacciones hidrofóbicas y el anillo aromático de las interacciones p-p. RP-MS usa una cadena alquílica optimizada para un recubrimiento más efectivo de la superficie de sílice con una reducción de las interacciones secundarias como Actividad frente a Compuestos Básicos (BA) y Compuestos Quelantes (C), y produce picos con muy alta eficacia y poca cola. La fase C8 tiene un Gráficos Radar similar a C18 y RP-MS pero con menor retención hidrofóbica.

Estas diferencias se muestran en los Gráficos Radar de la Figura 3.

Selectividad de la Gama de Fases Inversas Hypersil Gold 1.9 μm

Las columnas GOLD se basan en sílice de alta pureza de 175 Å y 220 m²/g de área superficial.

La fase Hypersil GOLD C18 tiene una selectividad y orden de elución predecible, pero ofrece nuevas posibilidades como una mejor forma de pico, una mayor capacidad de pico y superior sensibilidad, especialmente para compuestos a nivel de trazas.

La gama GOLD ofrece:

• C18
• C8 y C4
• C18 con Bloqueo Polar (aQ)
• Fenil
• Pentafluorofenil (PFP)

Como muestra la Figura 4, todas las fases tienen un bajo valor de Actividad frente a Compuestos Básicos (BA) y Compuestos Quelantes (C), tal como se espera del soporte de sílice de alta pureza y de los procesos propios de bloqueo y enlace usados en su fabricación. La fase Hypersil PFP muestra la mayor Selectividad Estérica (SS) de todas las fases inclusive PFP Accucore. Vale la pena notar que aunque C4 sea la menos hidrofóbica tiene una Selectividad Hidrofóbica (HS) similar a fenil y PFP.

Selectividad de la Gama de Fases Inversas Syncronis 1.7 μm

Las columnas Syncronis se basan en sílice de alta pureza de 100 Å y 320 m²/g de área superficial. Esta mayor superficie asegura una mayor retención de analitos por Retención Hidrofóbica (HR) y una mayor capacidad de carga. La gama Syncronis ofrece:

Syncronis C18 y aQ ofrecen una Retención Hidrofóbica (HR) muy alta tal como muestra el Gráfico Radar de la Figura 5. La Capacidad de Intercambio Iónico a pH 7.6 (IEXC7.6) es mayor en aQ que en las demás fases así como su Selectividad Estérica (SS).

La gama Syncronis incluye:

• C18
• C8 y C4
• C18 con Bloqueo Polar (aQ)
• Fenil
• Pentafluorofenil (PFP)

La Figura 6 muestra un resumen de las Retenciones Hidrofóbicas (HR) y Selectividades Estéricas (SS) de todas las fases comparadas. Si SS<1 se produce una inversión en el orden de elución del o-terfenilo y trifenileno, que son los compuestos usados para valorar ese parámetro.

Conclusiones

Al trabajar en LC Rápida es importante tener una amplia selección de diferentes químicas para explorar durante el desarrollo del método. Las siguientes recomendaciones pueden usarse para seleccionar correctamente la columna:

• La gama Syncronis de elevada superficie ofrece gamas muy retentivas para compuestos polares y moderadamente polares
• La gama GOLD muestra las menores interacciones secundarias, y genera los picos más simétricos con analitos difíciles como bases y quelantes
• La gama Accucore de núcleo sólido ofrece una amplia gama de químicas de amplia selectividad
• Syncronis aQ y C18 tienen la máxima retención hidrofóbica
• Las fase perfluoradas (GOLD PFP y Accucore PFP) muestran la mayor selectividad estérica.
• Las fases con grupos aromáticos, Fenil y Fenil-Hexil muestran una selectividad estérica inversa que las fases PFP.