Precolumnas y Bucles de Retención (Retention Gap)
Una precolumna y un bucle de retención son accesorios similares pero con objetivos diferentes. Ambos son un tubo de sílice desactivada, o en los sistemas más modernos, un tubo de sílice pretratada con metilsilicona (Fase Tipo 1), fenilmetilsilicona (Fase Tipo 5) o polietilenglicol (Fase Tipo Wax) de 2 a 5 metros que se instala entre el inyector y el comienzo de la columna. (ver Figura 1). Los tubos desactivados no contienen fase estacionaria con lo que se minimizan las interacciones con los analitos, mientras que los tratados con alguna fase suelen presentar mayor inercia química frente a compuestos muy polares.
La unión entre la precolumna y la columna principal se puede efectuar mediante conexiones de vidrio o cuarzo (press-fit) o mediante conexiones de tipo GLT (Glass Lined Tubing) con sellos de vespel, vespel grafito o metálicos.
El primer sistema es más económico pero requiere una manipulación precisa y un corte perfecto de la columna (ver Figura 2) y de la precolumna para garantizar un cierre hermético.
Se suele aconsejar sellar de manera definitiva la unión con resina de poliimida, pero no es una buena solución porque:
- La poliimida puede contaminar tanto la columna como la precolumna con los consiguientes efectos negativos frente a los analitos.
- La unión es permanente y no se puede reutilizar la unión.
- El procedimiento descrito más adelante, si el corte de la columna y precolumna se ha efectuado en las debidas condiciones garantiza un sellado hermético y la reutilización de la unión de cuarzo.
El segundo sistema (ver Figura 1) basa do en una μ-unión genera un mayor coste inicial, pero si se han de manipular columnas y precolumnas continuamente, especialmente por personal no demasiado experto, resulta más económico y seguro a la larga. Es conveniente que los diámetros de los tubos sean parecidos, pero si han de ser diferentes es preferible que el diámetro de la precolumna sea mayor que el de la columna principal.
Se aconsejan precolumnas de 0.32mm con columnas de 0.25mm de diámetro interior.
Si la conexión ha de ser entre la columna principal y el detector y es necesario el uso de una longitud de tubo desactivado (caso general en los detectores MS) , el diámetro del tubo de conexión ha de ser el mismo o inferior al de la columna principal.
En el caso de usar un divisor (Splitter) para conectar la salida de columna a dos o más detectores diferentes es importante que la suma de las secciones de los tubos de conexión sea inferior a la sección de la columna analítica.
Si las conexiones son del tipo mini-unión o μ-unión la calidad del corte de los extremos de las columnas a unir no resulta tan crítica. Si se opta por un press-fit, sólo se obtendrán resultados positivos si los cortes son los más exactos posibles, puesto que la columna ha de mantener un cierre hermético tras una breve compresión contra la pared interna del tubo de cuarzo.
Si el corte es irregular (ver Figura 2) el cierre es también irregular y es probable que se produzcan fugas, o, lo que resulta más peligroso, que los solutos entren en contacto con la pared externa de poliimida de la columna, material que es muy adecuado para la protección del tubo de sílice, pero que al mismo tiempo es muy reactivo. Nunca selle las conexiones de las columnas con resina de poliimida: no solo es un procedimiento irreversible, sino que además existe el riesgo de inundar con resina la zona de interconexión de cuarzo, con lo que es segura la aparición de problemas de adsorción irreversible.
Si no se posee la debida experiencia para utilizar un cortador de zafiro, existen cortadores especiales de diamante que garantizan un corte perfecto (ver Cortador Shortix).
¿Cuándo se utilizan precolumnas?
Las precolumnas se usan cuando las muestras contienen residuos no volátiles que puedan contaminar la columna, haciendo que éstos se depositen en la precolumna inicial y no en la columna analítica.
Aunque los residuos no contaminen la columna principal, un exceso de éstos puede también ocasionar la aparición de deformaciones en la forma de los picos: un corte o substitución periódica de la precolumna devuelve el sistema a sus condiciones óptimas.
Recuerde: la aparición de asimetrías, colas o la disminución del área de algunos solutos sensibles es síntoma claro de que se ha de proceder a la substitución de la precolumna.
Las precolumnas han de tener entre 2 y 5 m de longitud para que sean efectivas y son de uso obligado si el clean-up de su muestra no es extremo, o si la muestra proviene de extractos vegetales o biológicos.
¿Cuándo usar bucles de retención?
Los bucles de retención se utilizan para mejorar la forma de los picos en cierto tipo de muestras, columnas y condiciones cromatográficas. Usualmente se utilizan entre 5 y 10 m de precolumna para obtener los beneficios de un bucle de retención. Las situaciones que más agradecen el uso de estos accesorios son las que requieran grandes volúmenes de inyección (>2 μL) en condiciones de Split-Less, On-Column o Inyección Directa, y existan grandes diferencias entre la polaridad del solvente y de la fase estacionaria. El efecto del bucle de retención (retention gap) resulta evidente en la forma del pico del solvente (mucha menos cola) y en la focalización de los compuestos más volátiles que eluyen en picos con muy alta resolución en la zona inicial del cromatograma. Muchas veces una precolumna también ofrece los beneficios de los bucles de retención pero, a causa de su menor longitud, son menos evidentes.
En los inyectores On-Column no hay ningún tipo de inserto ya que la muestra se deposita directamente en la columna. En este caso un bucle de retención es útil para proteger la columna de componentes de la muestra activos o no volátiles, para la focalización de los picos al «contener» el solvente en un volumen suficiente (ver Figura 3), y como interfase de conexión entre inyectores automáticos y columna de diámetro estrecho. o sistemas multidimensionales (LC/GC).
La longitud de un bucle de retención depende del volumen y tipo del solvente usado: más compatible es con la fase estacionaria más corta puede ser (0.5m por cada μL de hexano o 2-3m por cada μL de metanol inyectados en una fase apolar).
¿Qué tipo de fase es conveniente usar en un bucle de retención?
La Tabla 1 muestra cuales son las combinaciones, en función del tipo de desactivación de la precolumna, fase/solvente/aplicación.
Cómo Usar conectores Press-Fit
- Limpie la unión de cuarzo (press-fit) con acetona y deje que se evapore el solvente.
- Con un cortador cerámico, de zafiro, punta de diamante o circular, marque el tubo a unos 2 cm del extremo de la columna. Con los cortadores no circulares es suficiente una ligerísima presión del borde afilado sobre la zona de corte.
- Aplique una ligera presión para partir la columna en la zona de la marca. Si no lo logra vuelva al punto 2.
- Con una lupa de 10 a 20X inspeccione el corte (vea Figura 2). Si no es regular u observa fragmentos de poliimida o de cuarzo vuelva al punto 2 y repita la operación. Si tras algunos intentos no consigue un corte limpio cambie el tipo de cortador por uno circular de diamante (Shortix).
- Moje el extremo de la columna en Metanol y deje que evapore el solvente.
- Con cuidado inserte la columna en el press-fit limpio y presione ligeramente con los dedos hasta que la columna se «clave» en la pared interior del tubo.
- Inspeccione la unión con la lupa. Si el cierre es correcto notará que se ha formado un anillo regular de color más claro en la zona de contacto entre la columna y la pared interior del conector. Si no logra la formación de un anillo de contacto, es probable que tenga que desechar la unión. Vuelva al punto 1.
- Puede comprobar la ausencia de fugas introduciendo algunos μL de metanol con una microjeringa entre la parte externa de la columna y la interna del press-fit. El cierre es hermético cuando no se aprecian microburbujas de gas portador.
- Efectúe uno o dos ciclos de temperatura y compruebe el punto 8
- Recuerde: no utilice resina de poliimida para sellar las uniones.