Tony Edge, Tim Liddicoat, Luisa Pereira and Ken Meadows, Thermo Fisher Scientific Runcorn, UK

Introducción

El análisis de drogas presentes en fluidos biológicos plantea muchos retos al químico analista. Uno de los fluidos más comunes que se analizan es el plasma. Esta matriz resulta increíblemente compleja con miles de componentes desde estructuras muy complicadas como las proteínas de alto peso molecular hasta simples sales inorgánicas.
Otra complicación es que cada muestra es diferente, puesto que la concentración relativa de proteínas, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas pequeñas difiere en función de la hora del día, el estado del paciente o los alimentos que haya ingerido.⁽¹⁾
Además la muestra misma cambiará con el tiempo, pues las proteínas se desnaturalizan y otros componentes de la matriz también se degradan tanto a causa de efectos térmicos como debidos a la radiación ^(2-4).

Estas situaciones implican retos importantes para el analista puesto que la muestra como el instrumento analítico pueden cambiar claramente de una inyección a la siguiente ^(5,6) lo que añade complejidad añadida al análisis, como este artículo demostrará.

Para establecer el efecto que la matriz puede tener en las prestaciones de una determinación típica, se han empleado diferentes técnicas de extracción y se han efectuado una serie de experimentos para determinar la cantidad de matriz eliminada. Los compuestos usados en este test han sido una serie de benzodiazepinas, que son una de las drogas más prescritas como hipnóticos, sedantes, anestésicos, relajantes musculares y anticonvulsionantes ^(7,8). Se han descrito casos de abuso de benzodiazepinas como sobredosis deliberadas, su uso para fines criminales ⁽⁷⁾ y veterinarios ⁽⁹⁾ y el análisis de estos compuestos es importante en muchos laboratorios.

Experimental

Reactivos

El plasma de rata con anticoagulante EDTA se obtuvo de Charles River (Kent, UK).
Las Benzodiazepinas Alprazolam, Bromazepam, Cordiazepóxido, Clonazepam, Diazepam, Flunitrazepam, Flurazepam, Nitrazepam, Nordiazepam, Prazepam, Temazepam y Rriazolam de Sigma (St. Louis, Missouri, USA).
Agua, Metanol, Acetonitrilo, Solución Amoniacal y Acetato de Etilo de Grado HPLC se obtuvieron de Fisher Scientific (Leicestershire, UK), y el ácido Fórmico grado LCMS de Fluka (Alemania).

Equipos y condiciones cromatográficas

Se ha utilizado un equipo UHPLC (Accela, Thermo Scientific, San Jose, USA) para el análisis por cromatografía líquida.
La columna ha sido una Hypersil GOLD, 50 mm x 2.1 mm, con tamaño de partícula de 1.9 µm (Thermo Scientific, Bellefonte, Pennsylvania, USA, Cod. 25002-052130).

Las fases móviles fueron 0.1% ácido fórmico en agua [A] y 0.1 % ácido fórmico en Metanol [B].
El gradiente usado para la elución de los analitos fue:
95% [A] y 5% [B] durante 0.5 min, cambio lineal hasta 5% [A] y 95% [B] en 3 minutos y 95% [B] durante 1 minuto.
Se reequilibra a 95% [A] y 5% [B] y se mantiene durante 0.5 minutos.
El caudal fue de 0.6 mL/min, con volumen de inyección of 10 µL.
La Figura 1 muestra un cromatograma típico.
Las fases de Extracción en Fase Sólida (SPE) fueron del tipo Fase Inversa y de Modo Mixto de Intercambio Catiónico (SOLA y SOLA CX 10 mg/1 mL, Thermo Scientific, Runcorn, UK).

Preparación de Estándares y Muestras de control de calidad

Las soluciones madre de cada benzodiazepina se prepararon en metanol a una concentración de 1 mg/mL y las madres iniciales se diluyeron a las de trabajo en el rango de 20 to 20.000 ng/mL. Los estándares de plasma se prepararon por adición de 5 µL de la solución adecuada a 95 µL de plasma de rata, y, tras agitación durante 5 segundos, resultaron plasmas con concentraciones de 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1.000 ng/mL. Las muestras para el control de calidad (QC) se prepararon de modo similar a las concentraciones siguientes: 10, 100, 500 y 1.000 ng/mL. No se presentan en este artículo todos los datos obtenidos.

Preparación de las Muestras

Optimización EFS. Las condiciones óptimas de lavado y elución para todos los cartuchos se determinaros con el mismo procedimiento.
Los cartuchos se acondicionaron y equilibraron según las instrucciones del fabricante. El analito se añade a 1 mL de medio acuoso a una concentración de 1.000ng/mL.
El eluido de la etapa de carga se colecta en un vial de 2 mL.
Se aplica 1 mL de solvente de elución muy débil y de nuevo se recolecta el eluido. Este proceso se repite aumentando gradualmente la fuerza eluyente hasta alcanzar las condiciones de elución finales.
Se analizan los eluídos y se traza un gráfico del % de respuesta total de cada analito contra el solvente eluyente (ver Figura 2b).

El gráfico resultante permite determinar las condiciones óptimas de lavado y elución.
Para un desarrollo completo del método se deberán analizar los efectos de la matriz, de las condiciones de elución y de la estabilidad del compuesto, pues este enfoque sólo investiga las interacciones entre la fase estacionaria y el analito. En la mayoría de los casos la optimización con químicas diferentes resulta en la optimización de la eliminación de la matriz. En el caso de uso de fases de modo mixto la posibilidad de usar interacciones de intercambio fuerte o débil puede ser muy ventajosa.

Precipitación de Proteínas (PPT). Se mezclan 100 µL de plasma con 300 µL de acetonitrilo durante 10 segudos. Las muestras se centrifugan a 10.000 rpm durante 5 min. Se toma el sobrenadante y se evapora a sequedad bajo nitrógeno a 40ºC y se reconstituye con 100 µL de una solución Agua:Metanol: Ácido Fórmico (95:5:0.1 v/v).

Control de compuestos endogénicos. Los componentes de la matriz que están presentes en el plasma se han detallado en otras publicaciones ^[10,11], y el intento de desarrollar un enfoque que controle todos esos compuestos no resulta práctico. Es posible controlar ciertos componentes que se sabe que están presentes a altas concentraciones en la matriz y que son causante de supresión iónica como los fosfolípidos.
Estos compuestos tienen un grupo polar, y, en el caso que nos ocupa, un grupo fosfocolina unido a una cadena alifática. Como forman una bi-capa que constituye la membrana celular en las muestras de plasma están presentes en concentraciones muy altas. Para el control de los fosfolípidos no es necesario ajustar el espectrómetro de masas debido a su alta concentración presente en los sistemas biológicos. Existen transiciones de masa muy documentadas para este grupo de compuestos con una masa característica para el grupo fosfocolina de 184 amu ^[12]. La Tabla 1 ofrece una vista más detallada de las transiciones a controlar y de los fosfolípidos correspondientes.

Finalmente, para tener una vista general de las demás especies presentes en la matriz, se efectúa un mapa TIC en full scan del extracto del blanco. Es esta investigación se analizan dos escenarios diferentes:

1. El efecto de la inyección continua del extracto de una matriz biológica en el sistema analítico
2. El efecto memoria del sistema analítico al inyectar una serie de blancos acuosos tras la inyección de una muestra extracto de una matriz biológica

Ambos dan detalles sobre la estabilidad del sistema analítico.

Resultados

Optimización de la Extracción en Fase Sólida de Benzodiazepinas

La Figura 2 muestra los datos obtenidos en los experimentos de perfil de elución obtenidos con el sorbente de modo mixto de intercambio catiónico y una serie de benzodiazepinas. Se puede ver del gráfico que durante la carga y los lavados orgánicos ácidos de baja fuerza se eluyen muy pocos compuestos del cartucho. Aumentando la fuerza eluyente del solvente por encima del 40% de metanol algunos de los compuestos empiezan a ser eluidos del cartucho. Una vez que se ha efectuado un tercer lavado con 0.5 mL de Metanol y 5% de Amoníaco la mayoría de los compuestos han sido eluidos del cartucho. Estos datos se pueden usar tanto para determinar el lavado óptimo como las condiciones de elución más adecuadas.

Elución de Fosfolípidos

La Figura 3a muestra un gráfico de las diferentes concentraciones de fosfolípidos detectadas usando diferentes técnicas de extracción. El gráfico muestra que la cantidad de fosfolípidos eliminados de la matriz es muy amplia. La muestra de precipitado de proteínas es la técnica menos efectiva en la eliminación de fosfolípidos endogénicos de la matriz. Usando un adsorbente de modo mixto con intercambio catiónico se obtienen beneficios significativos, y se detectan en la muestra cantidades despreciables de fosfolípidos. Se puede ver de la figura que la cantidad de fosfolípidos que se obtienen del procedimiento analítico depende substancialmente de su naturaleza. Se podría deducir que, en este sistema analítico limpio, o las técnicas de eliminación de fosfolípidos de mayor peso molecular funcionan correctamente o que no se eluyen de la columna HPLC.

La figura 3b muestra un gráfico de la concentración de fosfolípidos frente a una serie de inyecciones. La primera inyección es la muestra de plasma con precipitación de proteínas y las nueve siguientes son blancos con agua, con la presunción que hay presencia de fosfolípidos. Se puede ver de la figura que en la primera inyección sólo se detectan fosfolípidos de baja masa molecular. Sin embargo al aumentar el número de muestras acuosas inyectadas los fosfolípidos de mayor masa molecular empiezan a eluir, y que estos compuestos en particular requieren varias inyecciones para ser eluidos de la columna analítica. Por ejemplo m/z 758, aún tras nueve inyecciones de muestras acuosas, sigue eluyendo de la columna, demostrándose claramente que el sistema analítico cambia con cada inyección y que si acaece alguna forma de supresión iónica, ésta será diferente de una inyección a la siguiente.

Mapas TIC con Diferentes Técnicas de Extracción

La Figura 4 muestra una serie de mapas TIC obtenidos tras inyecciones repetidas de plasma extraído con las tres técnicas antes descritas. Se puede ver del primer mapa que hay una diferencia substancial en la cantidad de componentes que eluyen con las diferentes técnicas de extracción. Las muestras tratadas con precipitación de proteínas muestran claramente la mayor cantidad de componentes identificados por el espectrómetro de masas. Es interesante mostrar que tras la primera inyección las muestras tratadas con materiales de modo mixto o fase inversa ofrecen resultados similares. Sin embargo, al aumentar el número de inyecciones, se puede ver que hay un incremento gradual de iones pesados (de 650 a 850) que eluyen al final del análisis cromatográfico de las muestra tratadas con materiales de Fase Inversa. Además también hay un incremento de componentes que eluyen a unos tres minutos y medio. Es evidente que este mismo incremento no sucede con el cartucho de modo mixto y que el mapa TIC de los extractos de plasma es consistente al aumentar el número de inyecciones.

La Tabla 2 muestra los datos de precisión generados en el experimento para una serie de compuestos a LLOQ con técnicas de extracción optimizadas sin adición de Patrón Interno. Los datos muestran claramente que la precisión obtenida con técnicas de extracción en fase sólida es superior a la obtenida con la técnica de precipitación de proteínas.

Conclusión

Este artículo ha presentado un proceso que permite comparar varias químicas de EFS y ha demostrado también que una eficaz limpieza de la muestra puede tener un efecto muy positivo en las prestaciones del experimento y en el conocimiento de algunas de las causas posibles que influyen en la reducción de la precisión.

Los datos muestran claramente que el método basado en precipitación de proteínas genera una muestra mucho más compleja para ser analizada, con concentraciones de componentes de la matriz superiores a las obtenidas con técnicas de EFS, como se ha demostrado en términos de trazas de fosfolípidos y mapas TIC.

En la mayoría de los métodos bioanalíticos es uso de estándares internos es común y pueden permitir superar problemas causados por respuestas inconsistentes de compuestos o por efectos matriz o bajas recuperaciones. Sin embargo el uso de patrones internos no resuelve los problemas debidos a bajas límites de detección, y el desarrollo de drogas más eficaces que requieren menos concentración terapéutica implica que los químicos analistas han de desarrollar y disponer de métodos robustos de extracción en fase sólida.

Referencias

1. G.R. Wilkinson, Advanced Drug Delivery Reviews, 27(2–3), 129–159 (1997).
2. R.D. Young and P.W. Fenimore, Protein Dynamics: Experimental and Computational Approaches, 1814 (8), 916–921 (2011).
3. Eugenia Pechkova, Victor Sivozhelezov and Claudio Nicolini, Archives of Biochemistry and Biophysics, 466(1), 40-48 (2007).
4. J. Abraham, J. Kelly, P. Thibault and S. Benchimol, J. Mol. Biology, 295(4), 853–864 (2007).
5. H. G. Gika, G. Theodoridis, J. Extance, A. M. Edge and I. D. Wilson, J. Chrom. B, 871(2), 279–287 (2008).
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9. L. Wang, H. Zhao, Y. Qiu and Z. Zhou, J. Chrom. A, 1136, 99–105 (2006).G. Liumbruno, A. A’Alessandro, G. Grazzini, L. Zolla, J. Proteomics, 73(3), 883–507 (2010).
10. H. G. Gika, E. Macpherson, G. A.Theodoridis and I. D. Wilson, J. Chrom. B, 871,(2), 299–305 (2006).
11. Y. T. Hui, T. Liddicoat, L. Pereira and T. Edge, The Column, 7,3 (2011).

Tony Edge es actualmente el Investigador Principal en R&D de la división de consumibles de cromatografía de Thermo Scientific. Tony tiene más de 10 publicaciones en revistas de referencia inclusive un capítulo sobre Cromatografía Turbulenta. En 2008 recibió el  Desty Memorial Lecture por sus contribuciones innovadoras en ciencia de separación y  el mismo año recibió el premio de excelencia clínica de  AstraZeneca.  Sus intereses actuales se centran en mejorar los procesos de extracción y en cromatografía líquida de alta temperatura. 

Tim Liddicoat es actualmente es jefe de aplicaciones en el  departamento de consumibles de  ThermoFisher. Tiene más de veinte años de experiencia en química analítica y se graduó en la Universidad de  Sunderland,y ha trabajado previamente como bioanalista, como especialista técnico en espectrometría de masas y como especialista en separación en el desarrollo temprano de drogas en la industria farmacéutica.

Luisa Pereira, tras completar sus estudios de postgrado en la Universidad de  Swansea, se incorporó directamente en Thermo Scientific,  donde ha sido recientemente ascendida a científico principal. Tiene muchas publicaciones notables sobre el uso de carbón grafitizado en HPLC.  Actualmente es profesor agregado de la Universidad de Liverpool, donde enseña un curso de postgrado sobre fundamentos de cromatografía.  Su interés se centra en el desarrollo de nuevas fases y nuevas tecnologías en columnas de HPLC, y también  tiene un papel activo en el desarrollo de LC de alta temperatura.

Ken Meadows es un especialista de aplicaciones senior que trabaja en técnicas de extracción en Thermo Scientific. Durante el último año ha sido miembro principal del equipo de desarrollo de SOLA la nueva fase de EFS de Thermo. Posee varias publicaciones en el campo de la preparación de muestras, especialmente en el control de materiales endogénicos de matrices biológicas.  Ha efectuado un gran número de presentaciones en todo el mundo sobre preparación de muestras y es un exponente principal en el tratamiento de muestras en  Thermo Scientific.