Introducción
Interchim ha estado presente en Cromatografía FLASH desde 1995 como distribuidor de diferentes productos hasta que en 2008 presentó su propia gama de equipos y consumibles que han revolucionado el concepto de purificación automática de productos de síntesis.
El proyecto ha culminado con equipos que permiten purificación por LC-Preparativa o FLASH en el mismo instrumento y la generalización del concepto UPFP® (Ultra Performance Flash Purification).
El concepto UPFP® es el resultado de la combinación de las últimas tecnologías que incrementan las prestaciones instrumentales y la robustez de los equipos, y la generalización de columnas de partícula pequeña de sílice esférica puriFlash®.
El resultado:
- Mayor rendimiento en la purificación de crudos
- Mayor capacidad de carga de muestra
- Purificaciones sensiblemente más rápidas
Hoy, Interchim ofrece la mayor gama de productos con 6 equipos para UPFP®, en la Figura 1 se muestra el modelo 4250, y más de 35 fases estacionarias disponibles (SiO2, C18, CN, NH2, MM, Poliméricas, intercambio…) todas diseñadas para la purificación y fácil escalado de HPLC Analítica a LC-Prep o LC-FLASH.
Interchim a continuado la revolución en la purificación con la introducción de su nuevo Detector ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) ideal para cualquier clase de compuestos como carbohidratos, péptidos, aminoácidos, lípidos y fosfolípidos, polisacáridos y oligo sacáridos, PEG’s o cualquier clase de moléculas sin grupos cromóforos que resultan indetectables en UV. El Detector ELSD puede usarse tanto en condiciones de Fase Normal (NP) o Fase Inversa (RP) en condiciones isocráticas o en gradiente y genera una factor de respuesta constante, no como en el caso de otros detectores que usan otras técnicas.
El Detector ELSD de Interchim ha sido desarrollado con la empresa SEDERE, empresa reconocida como líder en este campo, y ha sido diseñado específicamente para purificación o LC-Prep con una necesidad mínima de muestra (40 μL/min), con un nebulizador específico que opera a baja temperatura, un amplio rango de masas detectables (desde semi-volátiles a no volátiles), muy bajo mantenimiento y gas auxiliar que requiere muy baja presión.
SEDERE ofrece un avance significativo sobre otros competidores con su nueva tecnología de baja temperatura que permite la detección de compuestos no volátiles o semi-volátiles a baja temperatura preservando la integridad de moléculas termo-sensitivas.
Tecnología
Detector Evaporativo de Baja Temperatura por Dispersión de Luz (LT-ELSD)
En general todos los compuestos que sean menos volátiles que la fase móvil pueden ser detectados por una propiedad universal y no requieren la presencia de cromóforos, grupos funcionales polarizables, etc.
La respuesta del detector es directamente proporcional a la masa de compuesto eluido, por lo que proporciona una respuesta homogénea con moléculas de estructura similar que facilita la cuantificación o la hace posible si no existen estándares comerciales disponibles.
Las muestras pueden ser separadas con fases móviles en gradiente ya que éstas se eliminan del eluente antes de la detección y se acepta un amplio rango de modificadores como AcONH4, AcOH, HCOONH4, HCOOH, CO3NH4, TFA, HFBA, o N(C2H5)3.
Paso 1: Nebulización del Eluyente y Selección de Gotas Pequeñas
El eluyente de la columna se mezcla con un gas inerte y pasa por un estrecho orificio de un nebulizador para generar una neblina homogénea, compuesta de gotas de fase móvil que contienen el compuesto de interés. La tecnología SEDEX LT permite la selección de gotas en función de su tamaño para evitar que las más grandes entren en el tubo de evaporación (tubo de deriva). Las gotas más grandes requieren temperaturas más altas para su secado y son las responsables del incremento de ruido de fondo.
Paso 2: Evaporación a Baja Temperatura
El eluyente nebulizado pasa por un tubo de derivación calefactado para evaporar la fase móvil. El detector ha sido diseñado para evaporar fases móviles de alto punto de ebullición a muy baja temperatura. Esta prestación única minimiza la posible pérdida por descomposición térmica y hace que la tecnología SEDERE LT sea la más fiable en la detección de cualquier compuesto presente en la muestra.
Paso 3: Detección por Dispersión
El flujo de partículas sólidas entra en una celda con una fuente de luz y un fotomutiplicador o un fotodiodo. La intensidad de la luz dispersada por las partículas es proporcional a la masa del compuesto eluido.
Las moléculas del soluto de la niebla, ayudadas por una Focalización Asistida con Gas (GSF) pasan por un cabezal óptico diseñado para medir la luz dispersada. GSF con gas (nitrógeno) permite focalizar las partículas sólidas en el cabezal y aumentar la sensibilidad y la seguridad.
El detector dispone de la tecnología SEDERE LT que asegura una extraordinaria sensibilidad con compuestos térmicamente lábiles o semi-volátiles.
En resumen:
- Las partículas sólidas en suspensión dispersan la luz.
- Se mide la intensidad de la luz dispersada.
- Un fotosensor a 120º de la fuente de luz mide la luz dispersada.
- La interacción luz-soluto no tiene relación con la estructura molecular del compuesto.
- Hace falta una diferencia de volatilidad entre la fase móvil y el compuesto. Hay que prestar atención a la detección de compuestos muy volátiles o semi-volátiles.
- Se puede trabajar tanto en condiciones isocráticas o de gradiente
- No hay limitaciones de solvente puesto que se evapora antes de la detección.
- La señal sólo se genera por los compuestos no evaporados.
- La calidad del solvente importa: una elevada cantidad de residuos puede generar un alto nivel de ruido
- Análisis cuantitativo. La respuesta del ELSD es:
- A = a.mb con b ≠ 1
- Área Pico=a·Concentraciónb
¿Por qué la Evaporación a Baja Temperatura es importante en detección por ELSD?
En un detector por ELS el eluyente nebulizado se evapora al pasar por un tubo calefactado. La temperatura del tubo es indudablemente el parámetro más crítico al optimizar la detección. Si la temperatura es demasiado alta, los compuestos semi-volátiles o térmicamente inestables pueden evaporar o descomponer y no serán detectados.
El detector ELSD de Interchim puede evaporar solventes con alto punto de ebullición a temperatura baja. Como ejemplo una fase móvil compuesta por 100% de agua y a un caudal de 1 mL/min se evapora completamente a ¡32ºC!
Además el diseño novedoso ofrece prestaciones que son superiores a los sistemas que necesitan un dispositivo especial de baja temperatura (Peltier).
El diseño único de la celda de nebulización permite la selección de gotas como función de su tamaño. Las gota mayores, de más difícil evaporación, son las responsables de un mayor nivel de ruido. En el nebulizador de vidrio las gotas más grandes simplemente se descartan, permitiendo que la temperatura pueda reducirse sin comprometer la sensibilidad (superior relación señal/ruido).
La Figura 5 muestra la selección de las gotas como función de su tamaño. La niebla creada por el nebulizador está formada por gotas de tamaños diferentes. La celda de nebulización actúa como un Selector de Exclusión por Tamaño real, de tal manera que las gotas mayores (azules en la figura) se evacúan al residuo. Sólo las gotas de tamaño inferior al límite del sistema pueden fluir a través del tubo de deriva.
La mayoría de los otros ELSD no seleccionan las gotas y necesitan temperaturas superiores para alcanzar niveles de ruido aceptables durante el análisis, con sensibilidades mucho menores de compuestos semi-volátiles o termosensibles. El ELSD Interchim ofrece evaporación real a baja temperatura y la máxima sensibilidad para todo tipo de compuestos.
La nueva función SAGA (Sedex Automated Gain Adjustement)
Interchim ha desarrollado conjuntamente con Sedere una nueva opción que consiste de un sistema automático de ganancia del detector ELSD (SAGA, Sedex Automated Gain Adjustement), que adapta la ganancia para evitar la saturación en picos muy grandes y continuar detectando compuestos a muy baja concentración. Con SAGA el ELSD resulta no saturable sin impacto en la sensibilidad.
Aplicación. Separación de dos diastereoisómeros.
Otros sistemas sólo ven 1 pico a causa de la saturación del detector (ganacia alta) mientras que el Detector Integrado ELSD con SAGA puede ver todos los compuestos presentes en la muestra producto.
En el ejemplo se muestra la separación de 625mg de dos diastereoisómero en una columna de 25g PF-15SIHP-F0025 a un caudal de 15 mL/min. En el primer caso sólo se colecta un pico, en el segundo se detectan, y colectan por separado, los dos compuestos.
Conclusión
Sedere e Interchim, con su nueva avanzada tecnología, ofrecen una nueva solución para sus clientes.
- El sistema de ganancia automática se suministra con cualquier equipo puriFlash™ facilitando el uso y la detectabilidad de cualquier compuesto independientemente de la cantidad de crudo a purificar.
- Una ganancia baja no significa más sensibilidad y es posible no detectar las impurezas.
- Una ganancia alta permite la detección y colección de las impurezas pero con el riesgo de saturación de señal que causa que compuestos con tiempos de retención similares se colecten como uno solo.
- El desarrollo conjuntamente con Sedere del sistema SAGA, Interchim ofrece la alternativa pues permite detectar y colectar en la misma purificación tanto los compuestos a nivel de trazas como los mayoritarios sin riesgo de saturación del detector.
- Con SAGA no es necesario ajustar la ganancia en función de la masa de crudo y funciona desde cantidades muy pequeñas (2 mg) hasta cargas del 20% de la masa del lecho de la columna de purificación con la seguridad de todos los componenentes detectables sean colectados.
- SAGA permite Simplicidad, Flexibilidad y Confianza
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