La familia de columnas Thermo Scientific™ MAbPac™ HIC ha sido diseñada para la separación de Anticuerpos Monoclonales (mAbs) y productos relacionados mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). La química unica de estas columnas permite una elevada resolución, biocompatibilidad excelente y una selectividad complementaria adecuada para un amplio rango de ensayos de mABs y substancias relacionadas.
Puntos destacados
- Química de columna avanzada diseñada para la separación de mABs y productos biológicos relacionados
- Amplio rango de selectividad para las separaciones más complejas de mABs
- Biocompatibilidad excelente
- Elevada eficacia
- Fases muy robustas
Los Anticuerpos Monoclonales han demostrado ser excelentes modelos de drogas altamente selectivas y biocompatibles. Se están desarrollando varios tipos de productos mABs, incluyendo mABs intactos, fragmentos de mAB, y Conjugados Anticuerpo-Droga (ADCs), para el tratamiento del cáncer, enfermedades infecciosas e inflamatorias y otras enfermedades raras.
Los mABs se unen selectivamente con moléculas asociadas con enfermedades e inducen la muerte de células que expresan el objetivo o modulan vías de señalización.
El interés en terapias basadas en mABs ha aumentado el interés en la caracterización analítica de estas moléculas. Los mABs son muy heterogéneos y susceptibles de muchas modificaciones post traslacionales y mecanismos de degradación como la glicosilación, oxidación, reducción del enlace disulfuro, deamidación, isomerización, fragmentación y agregación.
Esas modificaciones tienen que ver a menudo con la estabilidad y la potencia del producto. En ADCs la conjugación de drogas resulta muchas veces en una mezcla de moléculas ADC con diferentes cargas de droga. Se ha demostrado que el número de drogas unidas al mAB directamente afectan a la seguridad y eficacia del producto. Por lo tanto resulta crítica la caracterización y el control completo de la hetereogenicidad de mABs y ADCs durante el desarrollo y producción-
Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)
HIC se usa ampliamente como un método ortogonal a la Cromatografía de Intercambio Catiónico (CEX) y de Exclusión (SEC) para la caracterización de mABs. HIC separa proteínas en base a la interacción reversible con la parte hidrofóbica de la fase estacionaria hidrofílica.
La fase móvil en HIC consiste generalmente en un agente desalante que, a altas concentraciones, retiene la proteína por una mayor interacción hidrofóbica con la fase estacionaria.
La figura 2 muestra un ejemplo de HIC en el que las proteínas se unen a la superficie HIC por interacción hidrofóbica con una fase móvil con alto contenido de sal. Al disminuir la concentración de sal las proteínas eluyen de la columna en el orden de su hidrofobicidad; la menos hidrofóbica eluye primero y viceversa. A diferencia de la Cromatografía de Fase inversa, HIC permite mantener la estructura nativa de la proteína, que resulta útil en los análisis posteriores.
Químicas disponibles
Aplicaciones
La familia de columnas Thermo Scientific™ MAbPac™ HIC ha sido diseñada para superar los retos de separación resultantes de la hetereogenidad, complejidad y diversidad de mAbs y sus compuestos relacionados. La combinación de tres columnas MAbPac™ HIC ofrece una amplia gama de selectividad para separar la mayoría de este tipo de moléculas con eficacia, bio-compatibilidad y robustez excelentes.
Por ejemplo the MAbPac HIC-10 resulta la más adecuada para mABs/proteínas intactas y agregados mAb mientras que MAbPac HIC-20 resuelve fragmentos de mAbs, mAbs oxidados y mAbs biespecíficos.
En el caso de ADCs MAbPac HIC-Butyl es la columna ideal para ADC conjugados con cisteína mientras que MAbPac HIC-10 y MAbPac HIC-20 resultan útiles en varias moléculas ADC propietarias como muestra la tabla sguiente.
Separación de ADCs
La cromatografía de Interacción Hidrofóbica se usa a menudo en la separación de ADCs de diferente relación droga/anticuerpo (DARs) puesto que el grupo citotoxina altera la hidrofobicidad del anticuerpo. El anticuerpo conjugado menos hidrofóbico eluye primero y al aumentar el número de drogas ligadas aumenta tambiém el tiempo de retención de cada ADC,
En la figura se muestra la separación de una muestra de un ADC mimético conjugado con cisteína en una columna MAbPac HIC-Butyl . Los ADC miméticos con conjugados entre una droga mimética y mAb via el grupo sulfhidrilo de los residuos intercadena de cisteína que resultan en una mezcla de anticuerpos cargados con 0 a 8 drogas. Esta columna resuelve bien los mAb y ADCs sin modificar con valores DAR entre 2 y 8.
Separación of Proteínas
Tanto MAbPac HIC-10 como MAbPac HIC-20 ofrecen alta eficacia y resolución en la separación de proteínas. Su química única ofrecen una biocompatibilidad excelente y una bajísima retención residual. Al contraio que las columnas butilo convencionales , MAbPac HIC-10 y MAbPac HIC-20 resultan adecuadas tanto para proteínas hidrofílicas como hidrofóbicas.
Separación de agregados mAb
La formación de agregados es un problema común durante la fabricación de mAbs terapéuticos y compromete la seguridad y eficacia de su uso.
La detección efectiva y su eliminación de los agregados de mAb resulta crítica para la calidad de la droga. El método más usado en HPLC para la detección y cuantificación de agregados en muestras de mAbs ha sido SEC.
Sin embargo varios estudios han mostrado el uso de cromatografía de intercambio catiónico e HIC como técnicas alternativas para la separación de agregados de mAB de los mAb nativos.
El cromatograma muestra las separación de agregados mAb de los monómeros en una columna MAbPac HIC-10. Los agregados se eluyen más tarde que el monómero principal gracias a su mayor hidrofobicidad, con algunas variantes hidrofílicas que también se detectan. En el ejemplo la química única de MAbPac HIC-10 permite que tanto los agregados como las variantes se detecten simultáneamente.
Separación de fragmentos de mAb
El análisis de los subdominios Fab y Fc que resultan de la digestión conpapaína es un proceso común para obtener más información sobre la muestra mAb. La framentación con papaína a menudo ofrece la resolución de variantes de mAb que no se detectan claramente al analizar el mAb intacto. Además se puede saber si la fuente de la variación es el dominio Fab o Fc.
HIC ofrece la resolución necesaria para la separación de fragmentso Fab y Fc y variantes relacionadas.
La figura muestra la comparación entre un mAb intacto y su digestión con papaína en una columna MAbPac HIC-20 que separa con eficacia los fragmentos Fab y Fc y las variantes de esos fragmentos.
La columna MAbPac HIC-20 ofrece una separación superior, una excelente forma de pico y la selectividad necesaria para el análisis de fragmentos de variantes
Separación de variantes de mAb oxidados
La oxidación de mAbs terapéuticos durante la producción o el almacenamiento es una mecanismo corriente de degradación y es un grave problema en la producción de mAb.
En muchos casos los mAb oxidados han perdido parcial o totalmente la potencia terapéutica en comparación con su forma nativa. El análisis de este tipo de degradación resulta crítica para asegurar la eficacia terapéutica de los productos mAb. La oxidación de los residuos de aminoácido en un mAb puede alterar su naturaleza hidrofóbica tanto por aumento de la polaridad de la forma oxidada o a causa de una modificación conformacional.
Para caracterizar mAb oxidados se usan métodos HPLC basados en hidrofobicidad como la fase inversa o HIC. La columna MAbPac HIC-20 ofrece uns resolución superior de las variantes oxidadas de mAb del producto nativo. MAbPac HIC-20 puede resolver variantes oxidadas de mAb sin fragmentación u otro metodo de preparación.
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