Método Rápido para el Análisis de 13 compuestos Antiretrovirales con una columna UHPLC y Equipo de Altas Prestaciones

Joanne Jones, Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK

Palabras Clave

Hypersil GOLD VANQUISH, antiretrovirales, UHPLC, tenofovir, lamivudina, emtricitabina, abacavir, zidovudina, rilpivirina, raltegravir, dolutegravir, darunavir, cobicistat, atazanavir, efavirenz, elivitegravir

Objetivo

Demostrar las ventajas del uso de una columna Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ VANQUISH™ UHPLC 1.9 µm y un equipo Vanquish UHPLC en el análisis rápido de 13 compuestos antiretrovirales.

Introducción

Los métodos de barrido para analitos múltiples suelen ser más rentables que los dedicados para pocos analitos. Sin embargo los métodos dedicados pueden ofrecer tiempos de análisis menores, una generación de datos más rápida y una mayor velocidad analítica.

El análisis de 13 retrovirales ofrece una buena demostración de un método analítico para analitos múltiples. Se demuestran también las ventajas de los métodos dedicados en el análisis de asociaciones o combinaciones de compuestos normalmente presentes en las Formas Farmacéuticas (ver Figura 1).

13 estructuras — **Figura 1**. Estructura de los 13 retrovirales analizados

Las tecnologías complementarias de las columnas Hypersil GOLD VANQUISH UHPLC y el sistema Vanquish UHPLC permiten la mayor prestación cromatográfica posible. El bajo volumen muerto en gradiente resulta ideal para separaciones en condiciones de gradiente a alta velocidad. El sistema está optimizado para reducir el ensanchamiento de banda extra columnar permitiendo mejorar significativamente el poder de separación de los ensayos analíticos. La pre-compresión inteligente de la muestra antes de la inyección y la pulsación extremadamente baja de la bomba permiten obtener una estabilidad de flujo extraordinaria y prolongar la vida de la columna.

La gama de columnas UHPLC/HPLC Hypersil GOLD VANQUISH ha sido desarrollada para ofrecer análisis cromatográficos reproducibles y fiables con una forma de pico excelente.

Las columnas Hypersil GOLD VANQUISH UHPLC^(*), basadas en sílice extremadamente pura, ofrecen picos muy simétricos, aún en el análisis de compuestos que notoriamente generan formas de pico pobres en químicas tradicionales basadas en sílice.

El medio Hypersil GOLD VANQUISH permite una fase estacionaria con selectividad C18 y un orden de elución predecible, pero, además, ofrece nuevas capacidades como una forma de pico mejorada, mayor capacidad de pico y mayor sensibilidad, especialmente en el análisis de compuestos a nivel de trazas.

(*) Columnas especialmente diseñadas para operar fiablemente hasta 1500 bar

Experimental

Consumibles

Columna Hypersil GOLD VANQUISH, 1.9 µm UHPLC, 50 × 2.1 mm (P/N 25002-052130-V)*
Agua grado LC-MS 18 MΩ∙cm Thermo Scientific™Barnstead™ Smart2Pure™ System (P/N 50129845)
Metanol Fisher Scientific™ grado HPLC (P/N M/4056/17)
Ácido fórmico Fisher Scientific grado Analítico (P/N 10559570)
Viales roscados de 2 mL Thermo Scientific™ Virtuoso™ boca ancha 9 mm y kit tapones (P/N 60180-VT400)

*V indica columna grado Vanquish certficadas para presiones de hasta 1500 bar.

Instrumentación

Los análisis se efectuaron con un sistema Vanquish UHPLC consistente en:

Equipo Base (P/N VH-S01-A)
Bomba Binaria H (P/N VH-P10-A)
Divisor de Muestra HT (P/N VH-A10-A)
Compartimiento Columna H (P/N VH-C10-A)
Pre- calefactor Activo (P/N 6732.0110)
Detector Diode Array HL (P/N VH-D10-A)
Celda Thermo Scientific™ LightPipe™ 10 mm (P/N 6083.0100)
Sistema de Identificación de Viales Thermo Scientific™ Virtuoso™ (P/N 60180-VT-100)

Software

Sistema Cromatográfico de Datos Thermo Scientific™ Dionex™ Chromeleon™ 7.2 SR2 MUa

Preparación de la Muestra

Las disoluciones de los 13 compuestos mostrados en la Tabla 5 se prepararon disolviendo 10 mg en 10 mL de Metanol o agua para generar soluciones primarias de 1 mg/mL. Las diluciones subsecuentes resultaron en una disolución final de trabajo en metanol/agua 75:25 (v/v) con una concentración de 25 µg/mL. (Cobicisat y abacavir a una concentración final de 75 µg/mL.)

El etiquetado de los viales se hizo mediante Virtuoso Vial Identification System.

Resultados y Discusión

En las condiciones descritas en la Tabla 1, (Método A) se obtuvo la resolución plena de los 13 compuestos con una excelente forma de pico en una ventana de detección de 2 minutos (Figura 2 y Tabla 2). La presión máxima del sistema a lo largo del gradiente fue de 820 bar, dentro de la especificación de contra-presión tanto de la columna Hypersil GOLD VANQUISH de 50 mm como del equipo Vanquish UHPLC, que puede operar rutinariamente a presiones de hasta 1500 bar.

**Tabla 1**. Condiciones de gradiente y caudal para el Método A

Figura 2. Cromatograma que muestra la separación de los 13 compuestos antirretrovirales — **Figura 2**. Cromatograma que muestra la separación de los 13 compuestos antirretrovirales (ver TABLA 2)

Tabla 2. Identificación de los picos, Resolución (Rs) y Asimetría (A) de los 13 antirretrovirales analizados. — **Tabla 2**. Identificación de los picos, Resolución (Rs) y Asimetría (A) de los 13 antirretrovirales analizados.

Para aumentar ulteriormente la velocidad, los compuestos antirretrovirales se analizaron en combinaciones de dosis fijas. Una combinación de dosis fija es la combinación de las drogas administradas en una tableta única para aumentar la eficacia y disminuir la resistencia a la droga ( ver Tabla 3).

Tabla 3. Drogas Antirretrovirales, Combinaciones Asociadas y Método Analítico usado — **Tabla 3**. Drogas Antirretrovirales, Combinaciones Asociadas y Método Analítico usado

Explotando las condiciones operativas máximas de la columna (incrementando el caudal), la ventana de detección se disminuyo de 2 minutos a aproximadamente 42 segundos, doblando la velocidad y manteniendo la resolución. En la Figura 3 se muestran cromatogramas de tres de las combinaciones de dosis fija. Estos tres cromatogramas han sido seleccionados para representar cada uno de los tres gradientes usados en el análisis de las combinaciones (Métodos B, C y D, Tablas 4, 5 y 6 ).

Figura 3. Cromatogramas representativos de combinaciones a dosis fijas. Una combinación de cada uno de los tres Métodos UHPLC. — **Figura 3**. Cromatogramas representativos de combinaciones a dosis fijas. Una combinación de cada uno de los tres Métodos UHPLC.

Tabla 4. Condiciones de Gradiente y caudal para el Método B — **Tabla 4**. Condiciones de Gradiente y caudal para el Método B

Tabla 5. Condiciones de Gradiente y Caudal para el Método C — **Tabla 5**. Condiciones de Gradiente y Caudal para el Método C

Tabla 6. Condiciones de Gradiente y Caudal para el Método D — **Tabla 6**. Condiciones de Gradiente y Caudal para el Método D

En cada aplicación se obtuvo resolución a línea de base con una reproducibilidad del tiempo de retención excelente (Tabla 7).

Tabla 7. Identificación de Pico, Resolución y Variabilidad del Tiempo de Retención en combinaciones de Dosis Fija — **Tabla 7**. Identificación de Pico, Resolución y Variabilidad del Tiempo de Retención en combinaciones de Dosis Fija

Conclusión

Explotando las capacidades de alta presión del sistema Vanquish UHPLC, conjuntamente con la columna Hypersil GOLD VANQUISH UHPLC y un gradiente binario simple, se ha demostrado que puede obtenerse un método para 13 compuestos con una ventana de detección de 2 minutos (y un ciclo completo de método de 2.4 minutos).

Para analizar combinaciones de dosis fijas se puede modificar el método analítico para disminuir la ventana de detección a 0.7 minutos y aumentar la velocidad del método..

Las prestaciones de la columna Hypersil GOLD VANQUISH UHPLC, combinadas con el bajo volumen de retardo de gradiente y una estabilidad de flujo excelente permiten:

Método UHPLC de Resolución completa de 13 drogas antiretrivirales en menos de 2.4 minutos
Métodos rápidos de resolución completa para 11 combinaciones de dosis fijas en menos de 1.6 minutos
Reproducibilidad excelente de los tiempos de retención y de la forma de pico

Vínculos Útiles

AppsLab Library

Se pueden descargar el eWorkflow y el Respaldo Chromeleon (cmbx) en AppsLab Library:

Cromlab S.L. Blog de Cromatografía