Introducción

La Cromatografía de Modo Mixto es una potente herramienta emergente en la separación de moléculas, en la que al menos dos modos de interacción, controlables por la composición de la fase móvil, coexisten simultáneamente. En los últimos años algunos productores de columnas HPLC como SIELC o Dionex han incluido en su gama de productos columnas con varias fases estacionarias de modo mixto.

Esta técnica se ha desarrollado debido a la necesidad de un mejor control de la retención de moléculas tanto polares como apolares. Una fase de modo mixto permite un mayor rango de aplicaciones en comparación con las de fase inversa o intercambio iónico y permiten el análisis simultáneo de compuestos orgánicos e inorgánicos, polares y no polares, neutros o ionizables.

Historia

Las interacciones de modo mixto se conocen desde hace varias décadas, y el diseño de las fases estacionarias para Cromatografía Líquida se ha enfocado hacia la eliminación de las interacciones secundarias para obtener un mecanismo de separación único y predecible.

Desafortunadamente la simplificación de los mecanismos de interacción limita la gama de compuestos analizables simultáneamente y limita el control de sus tiempos de retención. Como consecuencia, en los últimos años se han diseñado cientos de columnas de fase inversa todas con ligeras diferencias: al funcionar básicamente con mecanismos hidrofóbicos,  las interacciones secundarias débiles que poseen son de control muy limitado.

Tipos de Fases de Modo Mixto

En general las columnas modernas de Modo Mixto pueden ser de muy diferentes tipos según sean las interacciones que permitan.  En general pueden ser del tipo bimodal o trimodal:

• AEX/RP. Intercambio Aniónico/ Fase Inversa
• CEX/RP. Intercambio Catiónico/Fase Inversa
• AEX/CEX/RP. Intercambio Aniónico/ Intercambio Catiónico/Fase Inversa
• AEX/HILIC. Intercambio Aniónico/HILIC
• CEX/HILIC. Intercambio Catiónico/HILIC
• AEX/CEX/HILIC. Intercambio Aniónico/ Intercambio Catiónico/HILIC

Inicialmente, las tentativas para comercializar columnas de Modo Mixto fueron bastante limitadas y se emplearon varias alternativas.

La primeras fases de Modo Mixto Tipo I se basaban en fases estacionarias C18 con bajo recubrimiento de tal manera que los grupos silanoles libres ofrecían interacciones iónicas adicionales. Estos grupos tienen propiedades ácidas con pKa sobre 5. El inconveniente de este tipo de enfoque es que las inclusiones o contaminaciones en el gel de sílice pueden afectar a la acidez de los silanoles y se pueden crear de zonas iónicas no uniformes. La ionización de los silanoles dependían de la consistencia del recubrimiento parcial y de un estrecho pH de la fase móvil.

Otro enfoque en la creación de fases de Modo Mixto Tipo I  se basaba en la mezcla física de fases de interacciones diferentes para obtener el efecto de Modo Mixto, como C18 y SCX. (ver Figura 1, Modo Mixto Tipo I).

La segunda alternativa,  fases de Modo Mixto Tipo II, combina uno de los grupos de intercambio como parte del ligando hidrofóbico unido a la superficie del gel. Estas columnas muestran una mejor reproducibilidad y mejos control de la retención que las columnas de primera generación. Estas fases estacionarias se usan para el análisis de compuestos ácidos, básicos y neutros. En caso de interacción dual, los iones opuestos a la fase estacionaria se reteienen por interacción de intercambio iónico. . (ver Figura 1, Modo Mixto Tipo II).

Las fases de Modo Mixto Tipo II más conocidas pertenecen a la serie Primesep de SIELC.

La tercera alternativa, fases de Modo Mixto Tipo III, se basa en dos enfoques diferentes propiciados también por SIELC y Dionex.

Las columnas SIELC usan ligandos con propiedades de intercambio catiónico y aniónico y una cadena hidrofóbica que los soporta unida a la superficie de la sílice.

Las columnas Modo Mixto Tipo III de la serie Obelisc de SIELC usan este tipo de enfoque en su tecnología LISC.

Dionex usa lechos de intercambio iónico dispuestos en la superficie externa del gel de sílice que permite uno de los dos mecanismo de intercambio. La segunda interacción, además de la de tipo hidrofóbico, la genera el ligando hidrofóbico unido a la superficie interna del gel.

Dionex denomina esta tecnología como NSH (Nanopolymer Silica Hybrid).

Las columnas de Modo Mixto Tipo III tienen una superior capacidad y mayor control de la retención. Los compuestos iónicos se retienen por mecanismos de intercambio catiónico y aniónico y los compuestos hidrofóbicos por mecanismos de fase inversa. La gran ventaja de esta configuración es la habilidad de retener iones catiónicos y aniónicos al mismo tiempo con fases móviles con tampones de baja concentración. El estado iónico de la fase estacionaria y la relación entre los sitios de intercambio catiónico y aniónico se pueden ajustar modificando el pH de la Fase Móvil (ver Figura 1, Modo Mixto Tipo III).

Tecnología LISC (Liquid Separation Cell) de SIELC

Dos columnas complementarias, Obelisc R y Obelisc N, basadas en la tecnología LiSC ™ (Liquid Separation Cell), ofrecen un nuevo enfoque para separar una amplia variedad de moléculas pequeñas . Los tres parámetros principales de la fase móvil que permiten el ajuste de las propiedades de la columna son la concentración de tampón, el pH del tampón, y la concentración del modificador orgánico. (Ver Figura 3).

Las tres características principales de la celda la hacen diferente a los materiales cromatográficos tradicionales:

1. Una fuerza iónica en la celda significativamente mayor que la de la fase móvil, permitiendo una transferencia de masa rápida de los analitos cargados dentro y fuera de la celda aún con baja concentración de tampón en la fase móvil.
2. La fase estacionaria ocupa el volumen entero de la celda, no sólo las paredes como en otras fases estacionarias, permitiendo una elevada capacidad de carga de la fase.
3. Las cargas positivas y negativas del ligando de la celda separadas por una larga cadena orgánica permiten que tanto las cargas positivas y negativas participen simultáneamente en la interacción electrostática.

Obelisc R y Obelisc N pueden substituir múltiples columnas de HPLC como las de Fase Inversa (RP), Fase Inversa modificada (AQ)  con Grupo Polar Incrustado, Fase Normal (NP), Intercambio Catiónico (SCX), Intercambio Aniónico (SAX), Exclusión Iónica (SEC) e Interacción Hidrofílica (HILIC). (Ver Figura 4).

El desarrollo de Métodos se simplifica usando sólo dos columnas OBELISC y algunas fases móviles simples compatibles con MS o bajo UV (<220 nm).

Obelisc R y Obelisc N difieren en el tipo y proximidad de sus grupos cargados y la hidrofobicidad de sus largas cadenas.

• Obelisc R dispone de grupos catiónicos cerca de la superficie de la sílice separados de los grupos aniónicos por una cadena hidrofóbica (características de Fase Inversa).
• Obelisc N tiene grupos aniónicos cerca de la superficie de la fase separados de los grupos catiónicos por una cadena hidrofílica (características de Fase Normal).

Tecnología NSH (Nanopolymer Silica Hybrid) de Dionex

Aunque las fases estacionarias de tipo anfotérico pueden separar tanto analitos aniónicos como catiónicos mediante intercambio de sales más que intercambio de iones, los grupos funcionales de intercambio catiónico y aniónico pueden neutralizarse entre si por su proximidad, complicando el desarrollo de un método.

Con la tecnología NSH (Nanopolymer Silica Hybrid) Dionex resuelve en gran medida esos problemas. El nuevo material consiste en partículas de sílice esférica de alta pureza recubiertas de lechos de nanopolímero creándose una separación espacial clara de las regiones de intercambio catiónico y aniónico, permitiendo que ambos mecanismos funcionen simultáneamente y puedan ser controlados independientemente.

Muchas fases estacionarias para HPLC se basan en partículas esféricas  porosas de sílice  con un área superficial entre 50 y 500m²/g y poros entre 60 a 300 Å. Debido a su naturaleza porosa el área interna de los poros contribuye mayoritariamente al valor de áera superficial. Cuando se modifica covalentemente tanto la superficie interna como la externa de un gel de sílice con ligandos sililo con grupos ionizables, se pueden unir permanentemente a la superficie externa por atracción electrostática nanopartículas con carga opuesta de tamaños superiores a 300 Å y ser excluidas de la superficie interna de los poros. Como resultado se crea un material con una superficie interna con cargas opuestas a las de la superficie externa.

Debido a la separación espacial del dominio cargado positivamente del dominio con carga opuesta, el material funciona tanto como intercambiador catiónico y aniónico al mismo tiempo. La Figura 5 muestra la vía sintética de estos materiales híbridos.

Las columnas Dionex Acclaim Trinity P1 y Trinity P2 son típicas columnas NSH con las siguientes características generales:

• La columna Acclaim^® Trinity^™ P1 se basa en partículas de sílice esférica  de alta pureza. El poro interno se funcionaliza con una capa orgánica con propiedades de Fase Inversa ye Intercambio aniónico. La superficie externa se funcionalza con nanopartículas con propiedades de Intercambio Catiónico. Como resultado la columna ofrece retención de fase inversa, de intercambio aniónico y catiónico (AEX/CEX/RP), y pueden separarse en la misma determinación analitos neutros, ácidos y básicos.
• La columna Acclaim^® Trinity^™ P2 se basa en partículas de sílice esférica  de alta pureza. El poro interno se funcionaliza con una superficie hidrofílica enlazada covalentement que ofrece retención por intercambio catiónico, mientras que la superficie externa se funcionalza con nanopartículas con propiedades de Intercambio Aniónico. Como resultado la columna ofrece retención HILIC, de intercambio aniónico y catiónico (AEX/CEX/HILIC).

¿Para qué sirven?

Control de API’s y sus contraiones

La formación de sales es una etapa crítica durante el desarrollo de drogas porque ofrece superiores propiedades biofarmacéuticas y físico-químicas, fácil purificación y manipulación. Debido a sus diferencias en carga y/o hidrofobicidad los API’s (Active Pharmaceutical Ingredient) y sus contraiones se analizan normalmente con métodos diferentes que requieren también diferentes columnas y plataformas.

Columnas AEX/CEX/RP

La Figura 6 Muestra que Acclaim® Trinity™ P1 ofrece una selectividad ideal para la separación de contraiones farmacéuticos (cationes y aniones) con una simple fase móvil de acetonitrilo/acetato amónico. La selectividad de la columna se ha seleccionado para que los cationes eluyan antes que los aniones.

El Naproxeno, generalmente formulado bajo su forma sódica, es un antiinflamatorio no esteroideo (NSAID) que se usa como analgésico, antipirético y antiinflamatorio. Mientras que el ingrediente farmacéutico activo (API) es una molécula ácida altamente hidrofóbica, su contraión (Na⁺) no puede ser retenido en ninguna columna de Fase Inversa. La columna Acclaim® Trinity™ P1 tiene mecanismos de intercambio aniónico y catiónico, ademas del de fase Inversa, y permite la separación de ambas especies en una columna de sólo 50mm con una resolución y forma de pico excelente. Ver Figura 7.

La Figura 8 muestra la separación de una mezcla compleja de ácidos, báses, aminoácidos y compuestos neutros en Obelisc R que es una columna alternativa a la P2 de Dionex con mecanismos de retención similares (AEX/CEX/RP). Notar que el compuesto más hidrofóbico, tolueno (pico 6), eluye antes que los más polares 2.6-lutidina, benzilamina y ácido benzoico.

Columnas AEX/CEX/HILIC

La columna Acclaim® Trinity™ P2 es la columna complementaria a  Acclaim® Trinity™ P1 y permite una separación excelente de aniones y cationes mono y multivalentes a línea de base. La figura 8 muestra la resolución de doce iones en una fase única en la que coexisten mecanismos de intercambio aniónico y caiónico para obtener una separación óptima.

La columna complementaria a Obelisc R es Obelisc N que tiene características AEX/CEX/HILIC como Trinity P2. La Figura 10 muestra una separación de cationes y aniones en condiciones adecuadas para detección MS si fuera necesario.

Otras Aplicaciones de Cromatografía en Modo Mixto

Análisis de Carbohidratos

El análisis de carbohidratos puede efectuarse vía cromatografía iónica, de fase inversa o HILIC y también por cromatografía de gases (previa derivatización).

De todas las técnicas HILIC parece la más atractiva al ofrecer una superior separación de compuestos polares hidrofílicos como los carbohidratos. HILIC es fácil de implementar y funciona bien cuando fallas los métiodos tradicionales basados en cromatografía de fase inversa. Acclaim Trinity P2 ofrece interacciones HILIC además de las de intercambio aniónico y catiónico. La figura 11 muestra como dos monosacáridos  (fucosa y glucosa) y dos disacáridos (sacarosa y lactosa) se resuelven en una columna P2 de 100mm en una fase móvil 80% ACN a 60ºC.

Análisis de Herbicidas

El Glifosato y sus impurezas e intermedios de producción pueden separarse en una  columna Obelisc N combinando mecanismos de intercambio iónico e HILIC. El método mostrado en la Figura 12, puede usarse en el analisis de glifosato, ácido imminodiacético, su derivado N-fosfometilado, dietanolamina y sus impurezas en mezclas de reacción, aguas residuales y continentales mediante detección MS, CAD, ELSD y UV.

En la Figura 13 se muestra la separación a línea de base de dos herbicidas hidrofílicos muy polares como el paraquat y el diquat en condiciones de fase inversa con tampones a base de formiato amónico.

Conclusiones

• Las columnas de Modo Mixto pueden resolver lo que las columnas genéricas de fase inversa no pueden retener ni separar.
• Las columnas de Modo Mixto tipo Acclaim Trinity P1 son superiores a las  ZIC-HILIC  en el análisis de drogas farmacéuticas y contraiones.
• Las nuevas tecnologías NSH o LISC permiten separaciones en un único análisis y en condicones adecuadas para detectores sensibles a la composición de la fase móvil, que otras columnas tradicionales son incapaces de lograr.