FLASH, SOFTWARE

Intersoft X® de Interchim®: El Nuevo Software para Purificación Flash y LC-Prep dotado de Inteligencia Artificial, que se adelanta en el tiempo… (III)

Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona.

Para más información vea también las Entradas siguientes:

El proceso de síntesis de una molécula, pasa por varias etapas (diseño del método, control de las condiciones, purificación del crudo…) y la que suele ser lenta y que, en general, no puede ser desatendida es el proceso de purificación del crudo. 

Normalmente el técnico suele usar procedimientos estándar, que no siempre resultan los más eficientes en la obtención de un producto de alta pureza y con alto rendimiento.

De hecho el químico de síntesis frente a un crudo de reacción que ha de purificar se plantea las preguntas siguientes:

  • ¿Qué combinación eluyente/fase estacionaria es la más adecuada?
  • ¿Elución en Isocrático, por Etapas o por Gradiente?
  • ¿Qué cantidad máxima de crudo no sobrecarga la columna?
  • En mi CCF separo mis compuestos, ¿cómo transponer a Flash o LC-Prep?

En el primer caso una determinación preliminar se efectúa por CCF, normalmente en placas de SiO2, y un par de mezclas eluyentes estándar (Hexano/Heptano:Acetato de Etilo, Cloruro de Metileno:Metanol) casi siempre al 50%.

En el segundo se opta en general por una elución en  condiciones isocráticas. Esta etapa es muy lenta, requiere la presencia física de un operador, y dista mucho de utilizar el método de separación más adecuado a las características únicas de la molécula sintetizada.

El tercero se basa en la experiencia de cada operador pero en general se tiende a sobredimensionar la columna con el consiguiente gasto de tiempo y material.

El cuarto caso ya ni se plantea y funciona mucho el método de «prueba y error».

1. Intersoft X® Genius: la solución

Intersoft X® Genius es un potente software dotado de Inteligencia Artificia que permite, mediante el análisis detallado de los resultados de una separación en CCF, seleccionar las condiciones más adecuadas (gradiente, columna) para obtener la mejor separación posible, ergo máxima pureza, en el tiempo más reducido posible, ergo costes mínimos de purificación tanto en tiempo como en materiales.

El Test de los 4 Compuestos

Interchim ha diseñado un test específico para le verificación y puesta en marcha de sus equipos de purificación PuriFlash que comprueba tanto el método de inyección, la eficacia en la generación del gradiente y la detección adecuada.

El test se compone de 4 productos de polaridad creciente (Naftaleno, 1-Nitronaftaleno, 2-Nitroanilina y 3-Nitroanilina) y de difícil resolución (2-Nitroanilina y 3-Nitroanilina) a una concentración determinada (50mg de cada). Ver Figura 1 y 2.

Figura 1. El Test de los 4 Componentes

Como además no son solubles en las fases iniciales apolares (hexano, heptano, isooctano… etc) de un método de purificación en columna en condiciones de Fase Normal, han de ser depositados en un soporte inerte (Celite) y efectuar la inyección mediante el método de Carga Seca (Dry-Load).

Figura 2. Espectros UV de los componentes del Test 4 Productos

Seleccionando λ específicos por encima del Cut Off (256 nm) del Acetato de Etilo se obtienen los registros de los 4 componentes del Test 4 Productos de la Figura 3.

En  Parte IV. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con IPA se verá que con el uso de otros eluyentes se liberan ventanas (Acetato de Etlilo λ>254 nm, Isopropanol todo el rango) y se podrán seleccionar otras λ a las que los componentes del Test 4 Productos responden más específicamente.

Figura 3. Registros de los 4 componentes del Test de 4 Productos a λ específicas. Elución con Acetona. Notar deriva causada por la absorción del eluyente entre 240 y 300 nm (SCAN 200-400 nm).

Para comprobar la eficacia de Intersoft X® Genius en la generación de métodos la mezcla test se ha separado en CCF en las condiciones aconsejadas por Interchim: Hexano : Acetato de Etilo 80:20 y en otras condiciones con diferente fuerza eluyente (Ver Figura 4):

  • Hexano : Acetona 90:10 (FE 0.056)
  • Hexano : Acetona 85:15 (FE 0.079)
  • Hexano : Acetona 80:20 (FE 0.102)
  • Hexano : Acetona 75:25 (FE 0.125).

Se puede utilizar el Gráfico de la Figura 4 para calcular la FE e una mezcla binaria con eluyentes comunes Hexano como componente apolar (FE=0.01)

Figura 4. Variación de FE en función del % de B.
Las consiguientes CCF se han fotografiado mediante la aplicación TLC to Flash & Prep en versión Android (disponible también para OSX) que se puede descargar gratuitamente desde las tiendas correspondientes.
Figura 5. Test 4 Compuestos en CCF de SiO2. Hexano:Acetona en diferentes concentraciones. 1 Naftaleno, 2 1-Nitronaftaleno, 3 2.Nitroanilina, 4 3-Nitroaniliba. Notar que el Naftaleno tiene muy poca retención en cualquier condición de fuerza eluyente.
¿Por qué el uso de Acetona?
  • La Acetona tiene una fuerza eluyente superior a la del Acetato de Etilo (0.47 y 0.38 respectivamente) pero pertenecen al mismo Grupo de Solventes (G6) en el Triángulo de Selectividad (ver Cuatro simples consideraciones que mejorarán sensiblemente sus purificaciones FLASH) con lo que la Selectividad es similar.
  • La Acetona y el Acetato de Etilo tienen Espectros de absorción UV diferentes: mientras que la Acetona es transparente en la zona 215-240 nm, el Acetato de Etilo lo es a partir de 256 nm. Esta circunstancia puede resultar útil si los compuestos a separar absorben por debajo de 230 nm o menos. Ver Figura 5.
  • El acetato de etilo, de uso corriente, tiene una «absorción final» (absorbancia cerca de los 200 nm, que es el rango inferior de un detector UV)  y los compuestos de absorbancia similar se detectan mal a longitudes de onda bajas con este eluyente.
  • Puesto que la acetona es más polar que el acetato de etilo los productos eluirán antes reduciendo el tiempo total de purificación. Como la acetona cuesta la mitad que el acetato de etilo, se pueden reducir los costes operativos significativamente.
  • Las mezclas hexano/acetona se usan mucho en las purificaciones de productos naturales y puede usarse a altas concentraciones sin afectar demasiado las prestaciones de las columnas, cosa que sí sucede con el metanol.
  • Aún así, la acetona tiene algunos inconvenientes: en primer lugar es muy higroscópica y absorbe rápidamente humedad del aire. Los recipientes han de estar bien cerrados y al desarrollar placas de TLC es conveniente usar acetona «fresca».  En segundo lugar absorbe por encima de 230 nm, y no es conveniente con detectores con λ fija a 254 nm.
  • La acetona, como todos los compuestos carbonílicos, puede reaccionar con aminas primarias produciendo la correspondiente Base de Schiff (ver Figura 3, pico en cola del producto 3, ver más adelante la Nota correspondiente)
Figura 6. Zonas de Absorción Acetona y Acetato de Etilo

Los resultados de estos ensayos se muestran en : 

2. Intersoft X® Genius y «TLC to Flash & Prep»

La aplicación TLC to Flash & Prep permite en pasos muy simples transponer los datos obtenidos de una placa CCF y generar el mejor método Flash para la separación y purificación de los componentes de interés.

Tome una foto de su TLC con su Teléfono Inteligente o Tableta o seleccione de su librería una la foto de una TLC anterior

Sus compuestos se detectarán automáticamente o seleccione manualmente los de su interés con un simple toque.

La aplicación calcula los Rf y ΔCV (= ΔK). TLC to Flash & Prep indicará si los  Rf están en la zona adecuada para efectuar su purificación.

A partir del menor ΔCV obtenido del análisis de su placa TLC, la aplicación indica el nivel de dificultad de la separación.

Indique los solventes usados y sus proporciones al efectuar su CCF y añada comentarios relevantes en las áreas correspondientes

Guarde los datos de su placa TLC y envíela a un correo electrónico o a su puriFlash® mediante bluetooth o wifi: el software «Genius X» le recomendará el mejor método para una purificación con éxito y tomará el control del sistema.

3. TLC to Flash & Prep: Test 4 productos en Hexano:Acetona 85:15

Figura 7. My TLC. Imagen de CCF Test 4 Compuestos en C6:Ac 85:15 con Rf y DCV Calculados

A la izquierda se muestra la placa de CCF resultante con los datos calculados de Rf y ΔCV. (Ver Figura 7). Se puede concluir que la separación en estas condiciones es muy fácil y los valores de ΔCV (3.60 para 3 y 4, 2.66 para 2 y 3 y 1.05 para 3 y 4) indican una buena separación de los pares 1,2, 2,3  y más difícil del par 3 y 4.

Se ha seleccionado esta mezcla  Hexano:Acetona 85:15 porque su Fuerza eluyente es similar a la de la mezcla binaria Hexano:Acetato de Etilo 80:20 (FE 0.079 y  FE 0.082 respectivamente). Ver Figura 8.

Figura 8. Capturas de Pantalla de varias TLC con mezclas binarias Hexano:Acetato de Etilo y Hexano:Acetona.

En estas condiciones se puede comprobar que el compuesto 1 (Naftaleno) está fuera de la Zona de Confort marcada en el recuadro amarillo.

La teoría indica que para una correcta transposición de TLC (Cromatografía Planar, elución por capilaridad) a Columna (Cromatografía Tridimensional, elución por presión) se ha de intentar que los compuestos de interés eluyan en CCF entre los  valores de Rf comprendidos entre 0.1 y 0.4 (0.1<Rf<0.4).

Las soluciones son:

  1. Seleccionar los compuestos que eluyan en la zona de confort (en estas condiciones los compuestos 1 y 2), o…
  2. … seleccionar una mezcla eluyente de menor fuerza para permitir que la Zona de Confort incluya un mayor número de componentes.

La Figura 8 muestra las placas CCF par eluyente C6:AC 85:15 (FE 0.079) y 80:20 (FE 0.082) y los cálculos de Rf y ΔCV correspondientes al par P3 y P4 o para todos los componentes de la Mezcla T4P.

La Figura 9  «TLC to Flash & Prep» muestra los pasos seguidos desde la apertura de la Aplicación en un teléfono inteligente hasta el envío de los datos a un equipo PuriFlash® mediante Bluetooth (o  wifi).

Figura 9. «TLC to Flash & Prep». Pasos para crear un método; 1. Abrir Aplicación. 2. Seleccionar un Método Existente, o… 3. Abrir o tomar Imagen. 4. Ajustar Imagen. 5. Marcar Frentes y Productos. 6. Seleccionar Productos de interés. 7. Indicar condiciones TLC y masa de crudo. 8. Ver zona de Confianza y enviar Método
3.1. Caso Hexano:Acetona 85:15. Selección de los 4 Compuestos (P1, P2, P3 y P4)

Ya se ha indicado que uno de los 4 compuestos se encuentra fuera de la Zona de Confort pero… ¿Genius X será capaz de generar un método adecuado en esas condiciones?

La Figura 10 muestra la pantalla de Selección de Compuestos (en este caso lo 4 componentes del Test), Columna y Método de inyección combinada con la Presentación del gradiente en forma de Tabla o Gráfico del método propuesto:

Figura 10. TLC Test 4 Productos C6:AC 85:15. Selección de todos los compuestos

A la izquierda  una representación simplificada de la Imagen de la CCF con los 4 componentes seleccionados, la cantidad de crudo a purificar (200 mg), el porcentaje de Hexano (85%) y de Acetona (15%), una serie de columnas propuestas (en azul las preferibles) y el modo de inyección. En el caso que nos ocupa al no ser soluble el producto en 98.4:1.6 de eluyente Genius X propone la inyección por Dry-Load (Carga Seca) y el tamaño de cartucho más adecuado.

En la parte superior derecha se muestra el gradiente propuesto en Formato Tabla y en la inferior en Formato Gráfico.

Aunque Genius X ha generado un método, técnicamente hablando, todos los compuestos se encuentran fuera de la Zona de Confort.

El Gradiente en estas condiciones tiene la siguiente variación de FE:

Figura 11. Variación de FE correspondiente al gradiente propuesto por Genius. En ROJO seleccionando los compuestos más retenidos (P3 y P4), en AZUL seleccionando todos los compuestos (inclusive P1 que está fuera de la Zona de Confort).
3.2. Caso Hexano:Acetona 85:15. Selección de los Compuestos peor resueltos

En el caso con Acetato de Etilo (Ver Parte II. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. Test con Acetato de Etilo) se pudo comprobar que aunque Intersoft X® Genius permite la selección de los componentes que están fuera de la Zona de Confort, es más conveniente seleccionar los compuestos para los que se debe optimizar la purificación: P3 2-Nitroanilina y P4, 3-Nitroanilina y permitir que Genius X recalcule de nuevo el método como muestra la Figura 12.

Figura 12. TLC Test 4 Productos C6:AC 85:15. Selección de los compuestos de peor resolución.

El Gradiente de Fuerza Eluyente ha sido modificado en consecuencia aportando las modificaciones necesarias para la separación óptima de los compuestos 3 y 4 (2-Nitroanilina y 3- Nitroanilina respectivamente).

La Figura 12 muestra el Gradiente de Fuerza eluyente calculado con los datos de la CCF eluída con C6:AC 85:15 y se compara con la calculada con Hexano:Acetato de Etilo 80:20:

Figura 13. Fuerza Eluyente resultante de la selección de los 2 compuestos peor resueltos. Mezcla C6:AC 85:15 Vs C6:EtAc 80:20

Como podría deducirse los dos gradientes son similares y como ambos eluyentes fuertes pertenecen al mismo Grupo 6 (ver  Estrategias en el Uso de Eluyentes en UPFP) los resultados de la purificación deberían ser similares, tal como muestra la Figura 14:

Figura 14. Test 4 Productos con selección de 2-Nitroanilina y 3-Nitroanilina para el desarrollo del método. Purificación superior con Acetato de Etlilo, inferior con Acetona.

La Tabla I muestra los datos cromatográficos relevantes para cada caso:

Tabla 1. Datos cromatográficos relevantes de las Purificaciones del Test 4P con EtAc y Acetona.

De la Figura 14 y de la Tabla 1 se puede concluir que el uso de Acetona ofrece las ventajas siguientes:

  • Opción de utilizar l más bajas para la detección aprovechando la ventana disponible entre 210 y 230 nm. Ver la Figura 1 para otras λ.
  • Ajustando la composición del eluyente en CCF para obtener FE similares, los Rf son también similares.
  • Intersoft X® Genius calcula un Gradiente de FE similar en ambos casos (ver Figura 13)
  • En el caso del Test T4P el uso para la detección de λ=225nm con acetona permite también mayor sensibilidad instrumental (ver P3 y P3 en la Figura 14.
  • La mayor fuerza eluyente de la acetona permite un resultado ligeramente mejorado con una Rs superior para Rt similares.
  • El coste de la acetona es sensiblemente inferior al del acetato de etilo

Sin embargo el uso de Acetona tiene algunos inconvenientes:

  • Es muy higroscópica y absorbe agua con facilidad con lo que la FE del sistema puede variar
  • La acetona absorbe por encima de 230 nm, y no es conveniente con detectores con λ fija a 254 nm.

La acetona, como todos los compuestos carbonílicos, puede reaccionar con aminas primarias produciendo la correspondiente Base de Schiff (ver más delante la Nota correspondiente y el pico enmarcado en la Figura 3)

NOTA. En la cola de P3 aparece un compuesto con un espectro ligeramente diferente:

Se analizó por GCMS la Fracción P3 con RT=15.54 y la P3B con RT=16:50.

La Fracción P3, correspondiente a la 2-Nitroanilina, dió una pureza del 100%, mientras que la P3B, contenía trazas de P3 y de otro producto que puede ser la Base de Schiff con la acetona, como parece confirmar el Espectro del pico eluido a RT=15.65.

Es probable que también se obtenga la Base de Schiff correspondiente a 3-Nitroanilina con la acetona, pero en las condiciones de la purificación probablemente no se resuelva del producto principal.

Para más información vea las Entradas siguientes: