Parte II. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. Test con Acetato de Etilo.
Para más información vea también las Entradas siguientes:
- Parte I. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un Click. Descripción General
- Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona
- Parte IV. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con IPA
- Parte V. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en cualquier condición. Las Funciones Flash & Go, BOOST y ORM en detalle
El proceso de síntesis de una molécula, pasa por varias etapas (diseño del método, control de las condiciones, purificación del crudo…) y la que suele ser lenta y que, en general, no puede ser desatendida es el proceso de purificación del crudo.
Normalmente el técnico suele usar procedimientos estándar, que no siempre resultan los más eficientes en la obtención de un producto de alta pureza y con alto rendimiento.
De hecho el químico de síntesis frente a un crudo de reacción que ha de purificar se plantea las preguntas siguientes:
- ¿Qué combinación eluyente/fase estacionaria es la más adecuada?
- ¿Elución en Isocrático, por Etapas o por Gradiente?
- ¿Qué cantidad máxima de crudo no sobrecarga la columna?
- En mi CCF separo mis compuestos, ¿cómo transponer a Flash o LC-Prep?
En el primer caso una determinación preliminar se efectúa por CCF, normalmente en placas de SiO2, y un par de mezclas eluyentes estándar (Hexano/Heptano:Acetato de Etilo, Cloruro de Metileno:Metanol) casi siempre al 50%.
En el segundo se opta en general por una elución en condiciones isocráticas. Esta etapa es muy lenta, requiere la presencia física de un operador, y dista mucho de utilizar el método de separación más adecuado a las características únicas de la molécula sintetizada.
El tercero se basa en la experiencia de cada operador pero en general se tiende a sobredimensionar la columna con el consiguiente gasto de tiempo y material.
El cuarto caso ya ni se plantea y funciona mucho el método de «prueba y error».
1. Intersoft X® Genius: la solución
Intersoft X® Genius es un potente software dotado de Inteligencia Artificia que permite, mediante el análisis detallado de los resultados de una separación en CCF, seleccionar las condiciones más adecuadas (gradiente, columna) para obtener la mejor separación posible, ergo máxima pureza, en el tiempo más reducido posible, ergo costes mínimos de purificación tanto en tiempo como en materiales.
El Test de los 4 Compuestos
Interchim ha diseñado un test específico para le verificación y puesta en marcha de sus equipos de purificación PuriFlash que comprueba tanto el método de inyección, la eficacia en la generación del gradiente y la detección adecuada.
El test se compone de 4 productos de polaridad creciente (Naftaleno, 1-Nitronaftaleno, 2-Nitroanilina y 3-Nitroanilina) y de difícil resolución (2-Nitroanilina y 3-Nitroanilina) a una concentración determinada (50mg de cada). Ver Figura 1 y 2.
Como además no son solubles en las fases iniciales apolares (hexano, heptano, isooctano… etc) de un método de purificación en columna en condiciones de Fase Normal, han de ser depositados en un soporte inerte (Celite) y efectuar la inyección mediante el método de Carga Seca (Dry-Load).
Seleccionando λ específicos por encima del Cut Off (256 nm) del Acetato de Etilo se obtienen los registros de los 4 componentes del Test 4 Productos de la Figura 3.
En Parte V. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en cualquier condición. Las Funciones Flash & Go, BOOST y ORM en detalle se verá que con el uso de otros eluyentes se liberan ventanas (Acetona entre 220-240 y por encima de 320, Isopropanol todo el rango) se podrán seleccionar otras λ a las que los componentes del Test 4 Productos responden más específicamente).
Para comprobar la eficacia de Intersoft X® Genius en la generación de métodos la mezcla test se ha separado en CCF en las condiciones aconsejadas por Interchim: Hexano : Acetato de Etilo 80:20 y en otras condiciones con diferente fuerza eluyente (Ver Figura 4):
- Hexano : Acetato de Etilo 90:10 (FE 0.039)
- Hexano : Acetato de Etilo 85:15 (FE 0.058)
- Hexano : Acetato de Etilo 80:20 (FE 0.077)
- Hexano : Acetato de Etilo 75:25 (FE 0.096).
Las consiguientes CCF se han fotografiado mediante la aplicación TLC to Flash & Prep en versión Android (disponible también para OSX) que se puede descargar gratuitamente desde las tiendas correspondientes.
Aunque el Acetato de Etilo es un solvente «polar» clásico también se utilizaron Acetona y Alcohol Isopropílico en alternativa, por las razones siguientes:
Acetona
- La Acetona tienen una fuerza eluyente superior a la del Acetato de Etilo (0.47 y 0.38 respectivamente) pero pertenecen al mismo Grupo de Solventes (G6) en el Triángulo de Selectividad (ver Cuatro simples consideraciones que mejorarán sensiblemente sus purificaciones FLASH) con lo que la Selectividad es similar.
- La Acetona y el Acetato de Etilo tienen Espectros de absorción UV diferentes: mientras que la Acetona es transparente en la zona 215-240 nm, el Acetato de Etilo lo es a partir de 256 nm. Esta circunstancia puede resultar útil si los compuestos a separar absorben por debajo de 230 nm o menos. Ver Figura 5.
- El acetato de etilo, de uso corriente, tiene una «absorción final» (absorbancia cerca de los 200 nm, que es el rango inferior de un detector UV) y los compuestos de absorbancia similar se detectan mal a longitudes de onda bajas con este eluyente.
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Puesto que la acetona es más polar que el acetato de etilo los productos eluirán antes reduciendo el tiempo total de purificación. Como la acetona cuesta la mitad que el acetato de etilo, se pueden los costes operativos significativamente.
- Las mezclas hexano/acetona se usan mucho en las purificaciones de productos naturales y puede usarse en altas concentraciones sin afectar demasiado las prestaciones de las columnas, cosa que sí sucede con el metanol.
- Aún así, la acetona tiene algunos inconvenientes: en primer lugar es muy higroscópica absorbiendo rápidamente humedad del aire. Los recipientes han de estar bien cerrados y al desarrollar placas de TLC es conveniente usar acetona «fresca». En segundo lugar absorbe por encima de 230 nm, y no es conveniente con detectores con λ fija a 254 nm.
- La acetona, como todos los compuestos carbonílicos, puede reaccionar con aminas primarias produciendo la correspondiente Base de Schiff (ver más delante la Nota correspondiente)
Alcohol Isopropílico (IPA)
- El Alcohol Isopropílico (IPA) tiene una fuerza eluyente muy superior (0.59) y además pertenece al Grupo 2 por lo que puede resultar interesante su uso si los compuestos a detectar no tienen grupos cromóforos o se busca una selectividad diferente.
- IPA se utiliza mucho como solvente intermedio si hay que pasar de Fane Normal a Fase Inversa i viceversa: es totalmente miscible con agua y con solventes apolares como el hexano.
Lo resultados de estos ensayos se muestran en :
- Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona
- Parte IV. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con IPA
2. Intersoft X® Genius y «TLC to Flash & Prep»
La aplicación TLC to Flash & Prep permite en pasos muy simples transponer los datos obtenidos de una placa CCF y generar el mejor método Flash para la separación y purificación de los componentes de interés.
Tome una foto de su TLC con su Teléfono Inteligente o Tableta o seleccione de su librería una la foto de una TLC anterior.
Sus compuestos se detectarán automáticamente o seleccione manualmente los de su interés con un simple toque.
La aplicación calcula los Rf y ΔCV (= ΔK). TLC to Flash & Prep indicará si los Rf están en la zona adecuada para efectuar su purificación.
A partir del menor ΔCV obtenido del análisis de su placa TLC, la aplicación indica el nivel de dificultad de la separación.
Indique los solventes usados y sus proporciones al efectuar su CCF y añada comentarios relevantes en las áreas correspondientes. 
Guarde los datos de su placa TLC y envíela a un correo electrónico o a su puriFlash® mediante bluetooth o wifi: el software «Genius X» le recomendará el mejor método para una purificación con éxito.3. TLC to Flash & Prep: Test 4 productos en Hexano:Acetato de Etilo 80:20
A la izquierda se muestra la placa de CCF resultante con los datos calculados de Rf y ΔCV. (Ver Figura 7). Se puede concluir que la separación en estas condiciones es muy fácil y los valores de ΔCV (2.78 para 1 y 2, 1.49 para 2 y 3 y 0.61 para 3 y 4) indican una buena separación de los pares 1,2, 2,3 y más difícil del par 3 y 4.
Se puede comprobar que los compuestos 1 y 2 (1-Nitronaftaleno y Naftaleno) están fuera de la Zona de Confort marcada en el recuadro amarillo.
Analizaremos los resultados obtenidos tanto por selección de todos los compuestos, por selección de algunos compuestos y en otras condiciones de fuerza eluyente.
La Figura 8 «TLC to Flash & Prep» muestra los pasos seguidos desde la apertura de la Aplicación en un teléfono inteligente hasta el envío de los datos a un equipo PuriFlash® mediante Bluetooth (o wifi).
3.1. Caso Hexano:Acetato de Etilo 80:20: Selección de los 4 Compuestos
Ya se ha indicado que dos de los 4 compuestos se encuentran fuera de la Zona de Confort pero… ¿Genius X será capaz de generar un método adecuado en esas condiciones?
La Figura 9 muestra la pantalla de Selección de Compuestos (en este caso lo 4 componentes del Test), Columna y Método de inyección combinada con la Presentación del gradiente en forma de Tabla o Gráfico del método propuesto:
A la izquierda una representación simplificada de la Imagen de la CCF con los 4 componentes seleccionados, la cantidad de crudo a purificar (200mg), el porcentaje de Hexano (80%) y de Acetato de Etilo (20%), una serie de columnas propuestas (en azul las preferibles) y el modo de inyección. En el caso que nos ocupa al no ser soluble el producto en 97.7:2.3 de eluyente Genius X propone la inyección por Dry-Load (Carga Seca) y el tamaño de cartucho más adecuado.
En la parte superior derecha se muestra el gradiente propuesto en Formato Tabla y en la inferior en Formato Gráfico.
Aunque Genius X ha generado un método, técnicamente hablando, los compuestos 1 y 2 (Naftaleno Rf=0.65, 1 Nitro Naftaleno Rf=0.47) se encuentran fuera de la Zona de Confort. Cabe pues deseleccionarlos y permitir que Genius X recalcule de nuevo el método como muestra la Figura 10.
El Gradiente de Fuerza Eluyente ha sido modificado en consecuencia aportando las modificaciones necesarias para la separación óptima de los compuestos 3 y 4 (2-Nitroanilina y 3- Nitroanilina respectivamente).
La Figura 11 muestra la diferencia de Fuerza eluyente en cada uno de los dos casos anteriores:
La Figura 12 muestra los resultados obtenidos seleccionando sólo los compuestos en la Zona de Confort (Pico 3, 2-Nitroanilina Rf=0.28 y Pico 4, 3-Nitroanilina Rf=0.16) o seleccionando los 4 compuestos, inclusive los que están fuera de la zona de confort.
NOTA. La selección de los 4 compuestos (1, 2, 3 y 4) o de los más cercanos a la Zona de Confort (2, 3 y 4) genera el mismo gradiente ya que la IA de Genius excluye del cálculo el producto menos retenido. Ver el caso de la elución 85:15 que se muestra más adelante (el Naftaleno tiene muy poca retención).
La Tabla 1 muestra las variaciones de los parámetros básicos de la purificación en los dos casos:
La selección de los compuestos más difíciles (3 y 4) conduce a una separación similar ligeramente más rápida con muy buena Resolución (RS). Hay que indicar que un valor de RS=1,5 indica una separación completa para picos de altura similar aunque su pureza puede que no sea del 100% (RS>1,5 para purezas del 98-100%).
3.2. Caso Hexano:Acetato de Etilo 85:15: Selección de los Compuestos en la Zona de Confort de Rf
Como se ha visto en el caso anterior la fuerza eluyente inicial de una mezcla C6:EtAc 80:20 (FE=0.077) parece ligeramente excesiva, pues dos de los 4 compuestos están fuera de la Zona de Confort (Rf3=0.47, Rf4=0.65).
¿Y si se disminuye ligeramente la FE con un eluyente C6:EtAc 85:15?
En estas condiciones la FE inicial es de 0.058 y la CCF generada se muestra en la Figura 13.
A la izquierda se muestra la placa de CCF resultante con los datos calculados de Rf y ΔCV. Resulta fácil concluir que la separación en estas condiciones es muy fácil y los valores de ΔCV (5.39 para 1 y 2, 2.77 para 2 y 3 y 0.96 para 3 y 4) indican una buena separación de los componentes de la Mezcla Test excepto para el Par 3 y 4 de separación más difícil.
Se puede comprobar que, ahora, sólo el compuesto 4 (Naftaleno, Rf4=0.61) está fuera de la Zona de Confort marcada en el recuadro amarillo. El compuesto 1 (Rf1=0.09) está en el límite inferior de la Zona de Confort.
La Figura 14 muestra la pantalla de Selección de Compuestos, Columna y Método de inyección combinada con la presentación del Gradiente propuesto en modo Tabla o modo Gráfico, en el caso de la Selección de todos los compuestos, mientras que la Figura 15 muestra la Selección de los Compuestos que están en la Zona de Confort (1, 2 y 3). El gradiente propuesto es el mismo ya que la IA de Genius excluye del cálculo el producto menos retenido.
Aunque Genius X ha generado un método, técnicamente hablando, los compuestos 1 y 2 (Naftaleno Rf=0.61, 1 Nitro Naftaleno Rf=0.38) se encuentran fuera de la Zona de Confort. Cabe pues deseleccionarlos y permitir que Genius X recalcule de nuevo el método como muestra la Figura 16.
La Figura 17 muestra los resultados obtenidos seleccionando sólo los compuestos en la Zona de Confort (Pico 3, 2-Nitroanilina Rf=0.19 y Pico 4, 3-Nitroanilina Rf=0.09) o seleccionando los 4 compuestos, inclusive los que están fuera de la zona de confort.
NOTA. La selección de los 4 compuestos (1, 2, 3 y 4) o de los más cercanos a la Zona de Confort (2, 3 y 4) genera el mismo gradiente ya que la IA de Genius excluye del cálculo el producto menos retenido.
La Tabla 2 muestra las variaciones de los parámetros básicos de la purificación en los dos casos:
Como era de esperar disminuir la FE incrementa el tiempo de retención y la duración total de la purificación pero RS aumenta sólo muy ligeramente.
La Figura 18 muestra la diferencia de Fuerza eluyente en cada uno de los dos casos anteriores (se incluye a trazos la FE del caso 80:20), y la Figura 19 muestra la comparación de los 4 resultados:
- Cálculo para TLC 80:20 y productos 2, 3 y 4
- Cálculo para TLC 85:14 y productos 2, 3 y 4
- Cálculo para TLC 80:20 y productos 3 y 4
- Cálculo para TLC 85:15 y productos 2, 3 y 4
La Tabla 3, muestra los valores de RT, y RS para las putificaciones mostradas en la Figura 19.
Como se puede deducir de los Datos de la Tabla 3, seleccionar todos los compuestos que entren en la Zona de Confort (ver 80:20 2,3,4 y 85:15 2,3,4) implica que Genius X recalcule el método para optimizar la separación entre todos los compuestos y genere un método mas lento. Para FE 0.076 (80:20 C6:EtAc) el Tiempo de Retención del Producto 4 (el más retenido) es de 20:20 minutos y 15:54 minutos si sólo se selecciona el par 3,4. En cualquier caso Rs es de 2.19 y 2.05 respectivamente, valores excelentes si se considera que para Rs>1.5 se considera una resolución total.
Un las condiciones de menor FE (FE 85:15 C6:EtAc 0.058) la separación del par crítico (productos 3 y 4) es mayor (Rs 2.22 y 2.05) a expensas de una duración total de la purificación también mayor (Rt P4=22:45 Productos 2,3,4 y Rt P4=18:24 Productos 3,4) como era de esperar.
Conclusiones
De los ejemplos anteriores se puede concluir que:
- Genius X permite obtener resultados óptimos con las mismas TLC’s usadas para el seguimiento de reacciones o comprobación de la pureza de los productos sintetizados.
- La IA de Genius X permite optimizar las separaciones en función de las necesidades del usuario (mayor velocidad, mayor pureza) sin la necesidad de complicados cálculos previos y se adapta a las características de la Fase Estacionaria y Geometría de Columna de las columnas disponibles por el usuario.
- Una condición importante es que los productos seleccionados estén en la Zona de Confort (los productos de interés han de eluir en CCF entre los valores de Rf comprendidos entre 0.1 y 0.4 (0.1<Rf<0.4)). En este caso las condiciones de Fuerza Eluyente pueden modificarse tanto para acelerar el proceso de purificación por UPFC (aumento de FE) como para incrementar la separación de un par con Rf muy próximos (disminución de FE).
- Los ejemplos anteriores se basan en condiciones operativas muy usuales en purificaciones en Fase Normal (Hexano y Acetato de Etilo), pero si el usuario prefiere utilizar otros eluyentes, para tener otras ventanas de detección, por ejemplo, Genius X recalcula las condiciones operativas para obtener los mejores resultados en cada caso.Ver Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona y Parte IV. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con IPA
- Con Intersoft Genius X, no se requieren conocimientos especiales de Cromatografía. ¡Cualquier técnico puede obtener excelentes resultados en su primer intento de purificación desde una adecuada separación previa por CCF!
Para más información vea las Entradas siguientes:
- Parte I. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un Click. Descripción General
- Parte II. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. Test con Acetato de Etilo
- Parte III. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con Acetona
- Parte IV. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en un click. TEST con IPA
- Parte V. Intersoft X® Genius o la Transposición de TLC a Flash en cualquier condición. Las Funciones Flash & Go, BOOST y ORM en detalle