Introducción
La Extracción en Fase Sólida, EFS, (o SPE, Solid Phase Extraction) sigue siendo la técnica más utilizada en la preparación de muestras.
La facilidad de uso y la flexibilidad de la EFS hace que sea el método previo de elección para limpiar y concentrar muestras antes de su análisis por HPLC, HPLC/MS, GC o GC/MS.
Los adelantos en los métodos analíticos obligan a mayores demandas y expectativas en el tratamiento de las muestras y requieren una mayor calidad de los productos EFS. Por este motivo los sorbentes poliméricos con elevadas capacidades de carga y sorbentes basados en sílice esférica ultrapura son de usos general.
La recuperación, capacidad selectividad y reproducibilidad son las principales demandas de los analistas en cuanto respecta a EFS y, por este motivo, Interchim ha desarrollado una gama de productos avanzados de alta tecnología. (Ver Tabla 1)
Tipos de Muestra tratables con EFS
La técnica EFS requiere que la muestra esté en fase líquida. Cerca de un 80% de las muestras pueden tratarse por EFS.
Las muestras líquidas pueden requerir un tratamiento previo de filtración para eliminar las partículas sólidas.
Las muestras sólidas han de extraerse previamente mediante Soxhlet, SFC u otras o solubilizarlas en un solvente apropiado.
Etapas de un Proceso EFS
1. Acondicionamiento
La activación del Sorbente y de los grupos funcionales se consigue pasando un volumen de un solvente apropiado o una mezcla de solventes a través de la columna.
Los discos porosos de la columna se solvatan al mismo tiempo
Generalmente se usa metanol o acetonitrilo para activar sorbentes hidrofóbicos, mientras que se usa hexano o cloruro de metileno para sorbentes hidrofílicos. Se recomienda usar entre 2 y 4 volúmenes de lecho. (¡Una vez activada no deje secar la columna!)
2. Carga de la Muestra
Aplique la muestra en la parte superior del lecho de sorbente. Los contaminantes de la matriz pasan sin ser retenidos por la columna, y otros componentes de la matriz pueden retenerse más o menos fuertemente en la superficie del sorbente.
Para obtener la máxima eficacia de purificación es conveniente controlar el caudal de la muestra.
Para aumentar el caudal de la muestra de muestras viscosas por la columna es necesario usar sorbentes de 90 a 140 μm. La capacidad de intercambio o la selectividad no resultan afectadas.
¡Es importante analizar la fracción no retenida para comprobar si todos los compuestos de interés han sido retenidos!
3. Etapa de Lavado y Secado
El lavado de la columna con solventes elimina compuestos que pueden interferir y deja atrapados en el lecho de sorbente los compuestos de interés. Se pueden usar diferentes mezclas de solventes para mejorar la eficacia de lavado.
A veces, es necesaria una etapa de secado. Los restos de solvente se evaporan haciendo pasar aire por la columna durante 2 a 10 minutos. Esta etapa mejora el rendimiento de extracción.
4. Etapa de Elución
Se pasa un solvente apropiado a través de la columna para alterar la interacción analito/solvente y poder eluir el 100% de los compuestos de interés.
El solvente apropiado ha de tener una interacción máxima con el compuesto de interés y mínima con las demás impurezas, dejándolas adsorbidas en el lecho de sorbente. Además su volumen ha de ser lo más pequeño posible para maximizar el factor de concentración.
Los compuestos de interés se concentran evaporando una parte del solvente. Si es necesario, se puede secar el eluato con sulfato de sodio anhidro para eliminar posibles trazas de agua y tener una muestra concentrada lista para ser analizada.
Recomendamos optimizar cuidadosamente todas las etapas según la extracción específica del usuario para mejorar la calidad del análisis final.
(Los sorbentes de partícula pequeña, 30 o 50 μm, necesitan un volumen de elución menor que los sorbentes de partícula más grande, como 90 o 140 μm.)
Definición de Volumen de Lecho
Se define como volumen de lecho la cantidad mínima de solvente necesaria para humedecer la cantidad de sorbente presente en la columna.
Este valor puede variar en función de la naturaleza del sorbente.
Por ejemplo:
- ~ 120 µl por cada 100 mg de sorbente de gel de sílice de 60 Å
- ~ 600 µl por cada 500 mg de sorbente de gel de sílice de 60 Å
(La elución incompleta del compuesto de interés puede suceder si la masa de sorbente es demasiado grande para el volumen de sorbente utilizado. Se puede producir una retención incompleta de compuestos de interés si la masa de sorbente es inadecuada haciendo que el compuesto eluya en una fracción o en el solvente de lavado, produciéndose bajas recuperaciones).
¿Haca dónde se dirige la Técnica de EFS?
La Industria Farmacéutica y las Instituciones Gobernativas están modificando el enfoque en sus laboratorios de I+D y QA/QC.
- Los analistas han de mejorar los costes de los análisis de drogas, impurezas, contaminantes…
- Se exige la disminución de los volúmenes de muestra y del límite de cuantificación
- Mejora de la detectabilidad
- Más implicaciones medioambientales
- Menos capital disponible para compras de equipos
- Aumentar la productividad del analista
- Eliminar los problemas experimentados con los equipos existentes
- Reducir los errores potenciales
Las Figuras 7 y 8 muestran cómo el 50% del tiempo del técnico se pierde en la preparación de las muestras y que un 19% de los errores se derivan de una técnica incorrecta.
¿Qué propone Interchim?
Para mejorar las técnicas basadas en EFS y disminuir los errores potenciales, Interchim propone:
- Usar sorbentes de partícula esférica frente a los materiales irregulares
- Una Estación de Trabajo Automática intuitiva, que mejore la productividad global en el tratamiento de la muestra mejorando la Repetibilidad y Reproducibilidad y el rendimiento de la Extracción en Fase Sólida:
- Interchim® SPE 6.25ws
- Con Desarrollo de Métodos y Preparación de Muestras
- Fácil de mantener
- Programación intuitiva
- Interchim® SPE 6.25ws
Interchim® SPE 6.25ws
Estación de Trabajo Compacta para EFS
Especificaciones
- Muestras de 0.1 a 25 mL (tubos de 18x150mm): 6
- Columnas:6
- Modo secuencial o en cascada.
- Un émbolo por columna
- Columnas de 1, 3 y 6 mL
- Hasta 9 recolecciones por muestra
- Racks de 13×100, 16×100 o 18x150mm
- Actualización rack on-line
- Entrada para 10 solventes + N2
- Software potente y simple.
- Pantalla de 9″
- Inyección de muestra automática
- Limpieza automática de aguja entre pasos
Un ejemplo: Extracción de Gb3 de Orina
Principio
La presencia de globotriaosilceramida (Gb 3 o ceramide trihexósido) en orina y plasma puede identificar a los pacientes sospechosos de Mal de Fabry y también controlar la terapia de substitución enzimática. Gb3 se extrae de la muestra con cloroformo/metanol (1:2) y de este extracto total, Gb3 se atrapa en una columna C18 (100 mg/1mL) y luego es eluído. La muestra obtenida se analiza directamente por LC/MS/MS.
Método
- Etapa de acondicionado 1: 1 mL Cloroformo/Metanol (1:2). Recolecta en Tubo 1
- Etapa de acondicionado 2: 1 mL Cloroformo/Metanol (1:2). Recolecta en Tubo 2
- Etapa de acondicionado 3: 1 mL Metanol. Recolecta en Tubo 1
- Pausa
- Tomar el Tubo de Recolecta 2 y ponerlo en el Rack de Muestras
- Carga de Muestra: 5,5 mL Recolecta en Tubo 3
- Etapa de Lavado: 700 μL Agua destilada. Recolecta en Tubo 3
- Etapa Elución 1: 500 μL Metanol/Agua (12:1). Recolecta Tubo 4
- Etapa Elución 2: 500 μL Cloroformo/Metanol (1:2). Recolecta Tubo 4
- Etapa Elución 3: 500 μL Cloroformo/Metanol (1:2). Recolecta Tubo 4
- Etapa Elución 4: 500 μL Cloroformo/Metanol (1:2). Recolecta Tubo 4
- Etapa Elución 5: 500 μL Cloroformo/Metanol (1:2). Recolecta Tubo 4
- Evaporación/Concentración
- Análisis LC/MS/MS
Resultados
Otro ejemplo: Extracción de Glc4 de Orina
Principio
Tetraglucosa Glc4 es una dextrina producida por la digestión amilolítica de los polímeros de la glucosa. Se encuentra normalmente en plasma y orina. La excreción aumenta ligeramente tras la ingestión de almidón, glicógeno y con la actividad física. La concentración de Glc4 aumenta también por la degradación endógena de glicógeno (lesiones, regeneración de tejidos).
Su nivel es significativo en muchas patologías:
- Enfermedad por Depósito de Glucógeno Tipo II (Mal de Pompe)
- Enfermedad por Depósito de Glucógeno Tipo III (Mal de Forbe)
- Enfermedad por Depósito de Glucógeno Tipo VI (Mal de Hers)
- Cánceres
- Pancreatitis aguda
- Enfermedades musculares (Miopatía de Duchenne…)
Las tetrahexosas urinarias (Hex4) se analizan como derivados butil-1,4-aminbenzoatos (BAB) por MS/MS, con un tetrasacárido marcado como estándar interno. Las moléulas se detectan por sus MRM’s específicos. La concentración de Hex4 se relaciona con la creatinina. Se estima que Glc4 representa aproximadamente el 90% de los tetrasacáridos urinarios. La orina se mezcla con el estándar interno de tetrasacárido marcado (13C6) y se incuba con el agente derivatizante: el exceso de reactivo y las sales presentes en la mezcla se eliminan por EFS.
Los oligosacáridos se eluyen de la columna EFS (C18, 100mg/1mL), el eluato se evapora a sequedad y se reconstituye en fase móvil. Se analizan por MS/MS en una columna C18 (3µm 100x2mm), Interchim® Uptisphere BioP2 (P/N:UP3BP2-100/021); Notar que las diferentes tetrahexosas no se separan. El aducto Glc4 y sodio y el estandar interno se detectan respectivamente por las transiciones 866>509 y 872>548.
Método
- Etapa de acondicionado 1: 1 mL Metanol. Recolecta en Tubo 1
- Etapa de acondicionado 2: 1 mL Agua. Recolecta en Tubo 1
- Etapa de acondicionado 3: 400 μL Acetonitrilo/agua (15/85). Recolecta en Tubo 1
- Carga de Muestra: 1,3 mL Recolecta en Tubo 2
- Etapa de Lavado 1: 1 mL Acetonitrilo/agua (15/85). Recolecta en Tubo 3.
- Etapa de Lavado 2: 1 mL Acetonitrilo/agua (15/85). Recolecta en Tubo 3
- Etapa Elución: 1 mL Acetonitrilo/agua (30/70). Recolecta en Tubo 4
- Evaporacióna sequedad
- Reconstitución en 0.5 mL de fase móvil
- Análisis LC/MS/MS
Resultados
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