Introducción
Los Anticuerpos Monoclonales (mAbs) son biomoléculas altamente complejas con masas de aproximadamente 150 kDa. Los MAbs se usan como proteínas terapéuticas en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer y enfermedades autoinmunes. Los anticuerpos han de ser caracterizados durante el proceso de producción del producto para asegurar que los atributos de la proteína alcanzan las especificaciones requeridas.
La mayoría de las herramientas analíticas para caracterizar mAb se basan en Cromatografía Líquida. Muchos métodos en LC tienen como objetivo la molécula intacta. La Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC), la Exclusión por Tamaño (SEC) y la Cromatografía de Intercambio Iónico (IC), resultan ser métodos de elección para la caracterización de anticuerpos intactos.
Gracias a la elevada eficacia cromatográfica de la Cromatografía de Fase Inversa (RPC), en comparación con HIC, esta técnica se usa como método complementario. Además la RPC se usa a menudo conjuntamente con Espectrometría de Masas con Ionización por Electrospray cuando se requiera este método de detección.
La Cromatografía de Fase Inversa (RPC) de anticuerpos intactos y proteínas grandes en general, requiere usualmente el uso de altas temperaturas para obtener picos de forma satisfactoria(1). Una temperatura elevada asegura una rápida transferencia de masas de las moléculas grandes y reduce el efecto de interacciones secundarias con la fase estacionaria(2). Otros problemas encontrados a menudo en el análisis de mAb’s por RPC son la pobre recuperación y efectos de arrastre de muestra.
La columna Thermo Scientific™ MAbPac™ RP ha sido diseñada para la caracterización de anticuerpos intactos. La fase está basada en partículas poliméricas estructuradas con poros ultra anchos (1500 Å) para asegurar la accesibilidad de proteínas muy grandes como los anticuerpos. El material polimérico ofrece una ventaja significativa sobre la sílice gracias a su estabilidad frente a la temperatura, bajo arrastre y un mayor rango de pH útil.
En este trabajo mostraremos la separación de muestra de un anticuerpo comercial intacto con un gradiente genérico. Se evaluarán las prestaciones cromatográficas, además de los efectos de arrastre, a diferentes temperaturas de columna.
Experimental
Instrumentación
Sistema Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex UHPLC que consiste en:
- Sistema Base (P/N VF-S01-A)
- Bomba Cuaternaria F (P/N VF-P20-A)
- Muestreador Split FT (P/N VF-A10-A)
- Horno columnas H (P/N VH-C10-A)
- Pre-calefactor activo, 0.1 × 380 mm, VH-C1 (P/N 6732.0110)
- Detector DAD HL (P/N VH-D10-A)
- Celda, 10 mm (P/N 6083.0100)
Se usan conexiones capilares estándar Thermo Scientific™ Viper™ para la interconexión de los equipos.
Proceso Datos
Se ha utilizado un Software de Proceso de Datos Cromatográficos Thermo Scientific™ Dionex™ Chromeleon™ versión 7.2 SR3.
Resultados
La elución de bevacizumab en la columna MAbPac-RP se efectúa a seis diferentes temperaturas de columna entre 50 y 110ºC. Se comparan tanto las áreas como la forma de los picos a cada temperatura. El cromatograma de la Figura 1 muestra que la retención disminuye con la temperatura y que una forma de pico excelente se obtiene entre 70 y 80ºC. Para mantener el balance térmico entre la fase móvil y la columna, y para evitar ensanchamientos de banda y efectos de retención no deseados causados por el choque térmico, el uso de un pre calefactor de fase móvil es extremadamente importante. Las especificaciones requeridas por un pre calefactor son la termostatización rápida del eluyente y bajo volumen interno para minimizar la dispersión extra-columnar. Ambas características se alcanzan con el calefactor de fase móvil activo del equipo Vanquish Flex UHPL.
En la Tabla 1 se muestran los resultados de los análisis de los picos a diferentes temperaturas. El área de pico aumenta al aumentar la temperatura entre 50 y 70ºC. Esta observación puede interpretarse como una mejor recuperación de proteína. Al aumentar más la temperatura el área disminuye que puede adscribirse a la degradación de proteínas provocadas por la alta temperatura.El arrastre ha sido estimado del cromatograma UV sin inyección (blanco), registrado tras dos análisis consecutivos de muestra. El pico del blanco se integra y se calcula el área relativa al pico de muestra. El arrastre es bajo a todas las temperaturas ensayadas y disminuye, como esperado, al aumentar la temperatura, siendo nulo a las temperaturas más altas. A 70ºC el arrastre estimado fue del 0.37%.
Conclusión
Este trabajo ofrece un ejemplo de optimización de temperatura en las separaciones por fase inversa de anticuerpos intactos. En el caso de bevacizumab, las condiciones óptimas en términos de forma de pico y recuperación se obtienen 70 °C. Esta temperatura debería interpretarse como un compromiso entre las mejores condiciones cromatográficas y la preservación de la integridad de la muestra. Esta condición óptima es , no obstante, la dependiente de la muestra, y se recomienda la optimización de temperatura en el desarrollo de métodos en fase inversa con cualquier nueva proteína intacta. Pese a que el arrastre indicado a 70 y 80 °C puede considerarse más que aceptable en la mayoría de las necesidades analíticas, ha de considerarse que es también específico de la muestra; su dependencia frente a la temperatura de la columna debe evaluarse siempre que se considere importante.
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Referencias y Autores
Michael Menz, Mauro De Pra, Evert-Jan Sneekes
Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany
- Dillon, T. M.; Bondarenko, P. V.; Rehder, D. S.; Pipes, G.D.; Kleemann, G. R.; Ricci, M. S. J. Chromatogr. A, 2006, 1120, 112–120.
- Fekete, S.; Rudaz, S.; Veuthey, J.-L.; Guillarme, D. Impact of mobile phase temperature on recovery and stability of monoclonal antibodies using recent reversed-phase stationary phases; J. Sep. Sci. 2012, 35, 3113–3123.