Test de Columnas: El Propósito

La importancia de un control cuidadoso y consistente de la calidad de las columnas de HRGC no debería ser subestimado. Existen, al menos, tres situaciones en que un control informativo de una columna es, prácticamente, esencial.

1. El Fabricante necesita conocer la calidad de su producto.  Básicamente necesita un control que sea comparable entre columnas fabricadas en un amplio período, que sea compatible con columnas de tipo diferente y que sea similar al efectuado por otros productores para efectos de comparación.
2. El Comprador que no comprueba una columna recientemente adquirida puede cometer un grave error porque no se puede excluir una amplia variación en la calidad de las columnas comerciales. La comprobación por parte del comprador es la única manera de que el fabricante le suministre los mejores productos.
3. El Usuario de columnas de HRGC debería comprobar periódicamente sus columnas para  detectar eventuales cambios de  prestaciones. Además, un test periódico genera información sobre lo que puede separar o no una columna y como puede alargarse su vida útil.

La política ideal de un laboratorio de análisis de rutina es combinar la comprobación con una limpieza periódica, puesto que una pérdida de prestaciones, que normalmente se atribuye a la columna, puede ser causada por el instrumento. Esta situación se detecta mejor con comprobaciones combinadas.

Test de columnas: Principios Básicos

Como no existe un test ideal que cubra toda la información de interés, y probablemente no exista nunca, al menos deberían cumplirse dos principios básicos:

1. Un Test General debe generar la mayor información posible para cualquier tipo de columna. Obviamente el propósito de este tipo de comprobación es proveer una clasificación básica de calidad.
2. Un Test Específico debería evaluar la habilidad de una columna en la solución de un objetivo analítico específico que frecuentemente se centra en algún detalle específico como la adsorción de substancias especialmente sensibles, la resolución de un par de isómeros, la elución de solutos básicos o ácidos, sangrado a alta temperatura…  Se puede diseñar un Test Específico basado en detalles críticos, y deberá contener clases de substancias críticas y algunos estándares internos que puedan variarse en función del tipo de columna.

¿Cómo se diseña un Test General?

En principio un Test General debería ofrecer la siguiente información en orden de importancia:

1. Inercia o capacidad adsortiva. En general se determina en términos de adsorción por enlace de hidrógeno con alcoholes primarios o dioles. También pueden usarse aldehídos, ésteres o compuestos aromáticos para investigar otros mecanismos.
2. Eficacia de Separación. Si se usa un programa de temperaturas, como en el 95% de las determinaciones, es necesario usar un término adecuado como TZ o Trennzahl.
3. Características Ácido/Base mediante pares débiles, como fenoles o anilinas, para detectar efectos fuertes o pares fuertes, como ácidos carboxílicos y aminas, para detectar efectos débiles.
4. Espesor de Film que se determina por la temperatura de elución de un compuesto determinado, por ejemplo un éster.

Un test diseñado bajo los parámetros anteriores se vuelve particularmente interesante si cumple las necesidades siguientes:

• Una Mezcla Test válida para cualquier polaridad de columna.
• Las datos han de obtenerse en un análisis único, sin condiciones de optimización.
• Generar información cuantitativa o semicuantitativa.
• El test debería funcionar a temperaturas relativamente bajas para operar con columnas con límites inferiores operativos bajos. Es difícil comprobar características de alta temperatura con un test general.

Los requerimientos anteriores sólo pueden satisfacerse con un test operado en condiciones de programación de temperatura, porque:

• Un test en Isoterma se basa en la optimización de la temperatura y requiere varias determinaciones. La programación de temperatura permite una optimización inmediata para cada una de las substancias.
• Una mezcla única puede ser aplicable para cualquier tipo de columna sólo si sus componentes cubren una amplio rango de volatilidades,  y que, normalmente, no suelen eluirse razonablemente bien en isoterma.
• La medida del espesor de film mediante la temperatura de elución hace indispensable la programación de temperatura.
• Por lo tanto, la eficacia de separación, ha de determinarse de un modo compatible con la programación de temperatura como el cálculo de  TZ (Trennzahl o Separation Number).

 El Test de Grob

El Test de Grob (Ver Bibliografía 1 y 2) cumple las premisas anteriores:

• Se efectúa en Programación de Temperatura. Toda la información generada depende de la temperatura y, en parte, del caudal. Por tanto se opera en unas condiciones estandardizadas que dependen de la longitud, del diámetro interior de la columna y del tipo de gas portador. En la Tabla 1 se muestran las condiciones experimentales optimizadas para columnas con espesores de film entre 0.08 y 0.4 μm y diámetros interiores entre 0.25 y 0.35mm.

• La Eficacia de Separación se determina mediante TZ (Treenzahl) con Ésteres Metílicos en lugar de Alcanos como suele ser usual. Sin embargo los alcanos eluyen de diferente manera en función de la polaridad de la columna, mientras que los ésteres dependen mucho menos de la polaridad: la parte polar y apolar de la molécula se compensan siempre que se seleccione bien el peso molecular.

• La Lista de substancias del test original, Test de Grob I, resultaba adecuadas para columnas que mostraban una cierta actividad.  Las columnas modernas son mucho más inertes y requieren una nueva versión, Test de Grob II, sin nonanal y undecano, ambos substitudos por el Dodecano.  El nonanal se ha eliminado puesto que, en las columnas modernas, la interacción con los aldehídos no es especialmente importante y, además, era una fuente de inestabilidad de la mezcla al poder interaccionar con las aminas para das bases de Schiff. Ver Tabla 2.

• El Espesor de Film se puede calcular conociendo la Temperatura de Elución de E12. En función de las Temperaturas de Elución para columnas con un film de 0.15 μm  y midiendo la diferencia, positiva o negativa  entre el valor medido y el valor estándar de la Tabla 3 se determina el valor actual del espesor de film de la columna según el nomograma mostrado en la Figura 1.

 Procedimiento Operativo del Test de Grob

1. Enfriar el horno de columna por debajo de 40ºC
2. Ajustar el caudal midiendo el tiempo de retención del Metano (compuesto no retenido). Ver Tabla 1.
3. Si no se dispone de una fuente de metano  se puede cualquier otro alcano gaseoso (como el gas de un encendedor C3/C4), teniendo en cuenta que no medirá tan exactamente el tiempo muerto.
4. Ajustar el programa de temperatura según la Tabla 1.
5. Inyectar 1 μL de Mezcla Test y ajustar la relación de split para que entren unos 2 ng de cada componente en la columna.
6. Tras la inyección iniciar inmediatamente el programa de temperaturas.
7. Registrar la temperatura de elución de E12. De la Tabla 3 y Figura 1 se puede determinar el espesor de film de la columna en examen.
8. Dibujar la «línea 100%» sobre los alcanos y ésteres. Vea la Figura 2.

   

9. Mida la altura de los demás componentes y regístrelos como porcentaje entre la línea de base y la «línea 100%»
10. Determine la eficacia midiendo TZ entre E10/E11 y E11/E12.

Conclusiones

La eficacia de la columna se determina por los TZ obtenidos entre los ésteres metílicos E10/E11 y E11/E12. Como las diferencias relativas en tamaño molecular de los pares homólogos disminuye al aumentar el peso molecular el primer TZ es aproximadamente un 8% mayor que el segundo. Normalmente se utiliza un valor medio entre los dos. En el caso de la Figura 2 es 31.5.

Los dos alcanos (C10 y C11) y los tres ésteres metílicos (E10, E11 y E12) se consideran compuestos no adsorbidos y los máximos de los picos se unen para crear la «línea 100%». La actividad de la columna se cuantifica midiendo la altura de los demás picos como un porcentaje de la distancia entre la línea de base y la «línea 100%». El valor obtenido tiene en cuenta todas las posibles distorsiones del pico: ensanchamiento, cola, adsorción irreversible y degradación. Los alcoholes OL y DIOL (1-Octanol y 2,3-Butandiol) se usan para medir la adsorción causada por mecanismos de enlace de hidrógeno. Las interacciones ácido/base se muestran por el comportamiento de 2,6-Dimetilanilina (A), 2,6-Dimetilfenol (P), Diciclohexilamina (AM) y el Ácido 2-Etilhexanoico (S). Tanto la Diciclohexilamina (AM) como el Ácido 2-Etilhexanoico (S) son test más indicativos del comportamiento ácido/base que P y A. En fases apolares es muy probable que S produzca un típico pico de sobrecarga. En este caso se puede usar el área en lugar de la altura para cuantificar las interacciones de la columna.

El espesor de film se calcula como descrito anteriormente, registrando la temperatura de elución de E12.

Es necesario indicar las limitaciones del test de Grob:

• No se puede usar con fases de muy alto punto de ebullición.
• El orden de elución no se ha determinado para todas las fases y deberá determinarse inyectando componentes individuales.
• El test está más enfocado hacia la determinación de la adsorción  y no tanto hacia la actividad catalítica. Las pérdidas por actividad catalítica dependen más del tiempo de exposición que de la concentración del componente. Al aumentar la temperatura de la columna, la adsorción disminuye mientras que la decomposición catalítica y térmica aumentan. El test de Grob no permite observar este tipo de degradación, y deberá ser modificado según el uso de la columna.

Bibliografía

1. K. Grob Jr., G. Grob and K. Grob.  J. Chromatogr. 156 (1978)
2. 1. K. Grob, G. Grob and K. Grob Jr.  J. Chromatogr. 219 (1981)