Sistema Open-Lab Interchim: Equipos de Purificación Híbridos FLASH/LC-Prep
Para integrar un Sistema de Purificación Híbrido como puriFlash® PF 5.250 (1) con detectores destructivos como iELSD o Interchim MS (2) es necesario un sistema de división (Splitter) que permita que una pequeña alícuota de la muestra pase al detector. Interchim utiliza una interfase de tecnología propietaria, para la división de la muestra sin pérdida de carga y con cualquier tipo de eluyente, acuosos para Fase Inversa, orgánicos para Fase Normal: Interchim MS Interfase (3)
Algunos sistemas de detección son destructivos por su naturaleza. Los más utilizados en UPFP o LC-Prep son los detectores Evaporativos de Dispersión de Luz (ELSD) o los Detectores por Espectrometría de Masas (MSD).
En HPLC o UPLC analítica no tiene mucha importancia la pérdida de la muestra, de hecho el interés se basa en la detección, cuantificación y determinación de la naturaleza de los analitos.
En UPFP o LC-Prep el objetivo principal es la recuperación de los analitos en la forma más pura posible y, por tanto, se tienen que evitar sistemas que limiten la recogida de las fracciones.
Además, la sensibilidad de los detectores MSD y ELSD y su relativa dinámica, obligan a un sistema adecuado de división de muestra que permita la detección sin saturación del detector y minimice la pérdida de producto.
Los sistemas más utilizados son los Divisores de Flujo Estáticos y los Divisores de Flujo Dinámicos.
1. Divisores de flujo Estáticos
Los divisores de flujo estáticos son muy elegantes por su simplicidad: las relaciones de división se crean mediante dos o más resistencias que crean un camino paralelo con relaciones de split (división) que dependen de la longitud y diámetro interno de los tubos.
Si se conocen las características de cada elemento se pueden crear diferentes combinaciones de tubos de longitud y diámetro interno para generar las relaciones de split adecuadas.
Este enfoque tan simple también se utiliza en sistemas de fabricantes muy reconocidos cuando se apartan del ámbito conocido de la HPLC clásica.
Una variante utiliza válvulas que simulan diferentes pérdidas de carga para ajustar la relación de split.
Aunque simples, estos divisores tienen algunas ventajas en HPLC o UPLC:
- Las relaciones de split son estables y reproducibles y no cambian por cambios de viscosidad o presión (purificación en gradiente)
- Volumen muerto muy bajo, pero que sólo es interesante en los caudales bajos usados en HPLC o UPLC analítica
Pero tienen grandes desventajas en Flash o LC-Prep:
- Es difícil obtener grandes relaciones de split como las necesarias en Flash o LC-Prep (1000:1, 10000:1 o más)
- A altas relaciones de split es difícil mantener pérdidas de producto bajas
- Generan una gran contrapresión, que limitan las especificaciones reales de los sistemas de purificación (limitación del tamaño de las columnas flash o del diámetro de las columnas LC-Prep) especialmente en condiciones de Cromatografía de Fase Inversa en las que se utilizan eluyentes con agua de viscosidad alta.
La Figura 4 muestra cómo varía la viscosidad de mezclas ACN:H2O y MeOH: H2O en función de la temperatura y concentración de solvente orgánico.
En condiciones de Cromatografía en Fase Normal en la que se utilizan eluyentes orgánicos, normalmente de baja viscosidad, las pérdidas de carga son limitadas, y el uso de caudales grandes limita en poca medida las especificaciones de los instrumentos tradicionales.
Pero en condiciones de Cromatografía en Fase Inversa, los eluyentes basados en mezclas agua : orgánico con viscosidades elevadas (Figura 4) limitan mucho las capacidades teóricas de los instrumentos dichos híbridos o LCPrep tradicionales.
El ejemplo de la Figura 5 muestra los datos del Manual de Usuario de un Instrumento Mixto (o Híbrido) *** 2250 de ***SON con el sistema de Split Fijo utilizado con su Detector ELSD:
La Viscosidad de ACN 100% a 20ºC es de 1.00 cP y con 90% agua y 10% Acetonitrilo es 1.14 cP (viscosidad máxima). A 25ºC las viscosidades son respectivamente de 0.89 y 1:01 cP.
El problema principal que limita el uso de Acetonitrilo es su coste y la gran mayoría de usuarios tienden a utilizar Metanol sensiblemente más económico pero más viscoso, lo que tiene gran importancia con la pérdida de carga que puede generar limitando las prestaciones reales del equipo de purificación.
En las condiciones del Manual de Usuario del fabricante de ese equipo (***SON, *** 2250) (Figura 5) la viscosidad del Metanol 100% a 20ºC es 1.00 cP y la mezcla Metanol : Agua 50:50 es de 1.83 cP a 20 ºC (viscosidad máxima). A 25ºC las viscosidades son respectivamente de 0.89 y 1.62 cP.
Las mismas indicaciones del Manual de Usuario (***SON, *** 2250) (Figura 5) indican que el tubo de Split tiene un D.I. de 0.005 «(0.127 mm) y 35 cm de largo.
¿Cuál es la pérdida de carga generada por un tubo de 0.005 «(0.127mm) y 35 cm de largo?
La Tabla 1 Muestra los resultados en las condiciones indicadas con la relación de Split variable.
Relaciones de Split entre 2 y 4% se consideran excesivas (pérdida de muestra notable), además de que las presiones altas (especialmente con gradientes acuosos y en condiciones de Fase Inversa) limitan considerablemente el uso de columnas Flash grandes o el diámetro efectivo de las columnas para cromatografía preparativa.
Como indicación el Split Dinámico de un detector iELSD, integrado con equipos de la serie puriFlash® de Interchim, en cualquier condición de caudal inyecta 40 µl / min (modificable vía software) ¡sin pérdida de carga!
La Tabla 2 Muestra los resultados en las condiciones indicadas con la relación de Split Fijo.
Aunque es complicado mantener una relación de split fijo constante, es posible que, para cada condición de caudal alto, se pueda mantener un caudal adecuado en la línea de bajo caudal (la que conecta con el detector MS, ELSD o Corona). Así se puede contener a un mínimo la muestra perdida que va al detector destructivo.
En cualquier caso, un Divisor de Flujo como el utilizado por un fabricante de instrumentos «híbridos» conlleva severas limitaciones en el tamaño de la columna FLASH (presión de servicio limitada) o en el Diámetro y / o Longitud de una columna de clase preparativa (limitaciones de la bomba, al perder parte de la presión disponible para compensar la pérdida de carga de un split fijo). En el caso de las columnas Flash las limitaciones se muestran en la Figura 6.
Columnas de fabricantes como ***la o ***hi causan limitaciones severas y columnas de más de 40g (F0040) son poco factibles debido a la presión máxima de diseño.
En el caso de las columnas preparativas, que tienen un límite de presión mucho más alto (> 350 bar) que la capacidad de las bombas (210-250 bares de los sistemas llamados «híbridos») las limitaciones introducidas por los Splitters Fijos de hecho lo hacen es limitar el diámetro, la longitud o el tamaño de las partículas de las columnas.
¡De hecho muchos instrumentos híbridos difícilmente pueden utilizar columnas de más de 30mm D.I., 250mm de longitud y partícula de 5 μm!
La Figura 7 muestra que un Split Fijo como el mostrado en la Figura 3 añade hasta 26-30 bares de pérdida de carga (con MeOH:H2O 50:50) a una columna de 250x30mm y 5 micras y la presión necesaria sube hasta 206 / 245 bar en lugar de los 180/215 teóricos, lo que pone la bomba en el límite de su capacidad.
¡Y sin tener en cuenta los efectos extra columnares de tubuladuras, válvulas y otros accesorios necesarios para el funcionamiento del sistema!
2. Divisores de flujo Dinámicos
En función de la aplicación, se puede efectuar una purificación con un detector UV-DAD, ELSD o con MSD.
En el primer caso (UV-DAD) el flujo que transporta la muestra a través de la columna, pasa por el detector UV-DAD y al colector de fracciones.
Pero tanto ELSD como MS destruyen el material durante el análisis. Además requieren velocidades de flujo y concentraciones de muestra más bajas en comparación con el caudal de flujo y concentraciones de muestra del caudal principal. Para evitar destruir toda la muestra purificada y entregar alícuotas de muestras de menor concentración en un flujo de baja velocidad, una parte del flujo principal se desvía hacia una línea separada denominada Make-Up. El disolvente o disolventes utilizados como Make-Up no siempre tienen que ser los mismos que los disolventes del flujo principal y, por tanto, están controlados con una bomba separada. El desvío se lleva a cabo mediante un divisor de flujo llamado Mass Rate Atenuador (MRA) fabricado por Rheodyne. El MRA transfiere mecánicamente un pequeño volumen del flujo principal hacia el flujo de Make-Up. El dispositivo es caro y tiene mucha más capacidad que la necesaria, es decir, puede desviar porciones más grandes de muestra y tolerar presiones más superiores que las necesarias en Cromatografía FLASH. El divisor también es una fuente potencial de acciones de mantenimiento debido al desgaste de sus componentes en movimiento.
La Figura 8 muestra un esquema general de un Split Dinámico basado en una válvula MRA. Es posible también la instalación de un detector ELSD en paralelo con un segundo divisor a la salida de la MRA principal y tener triple detección como muestra la Figura 12.
El Divisor Dinámico de un sistema Flash o Híbrido consta de tres partes clave:
- Bomba de Make-Up, para controlar el caudal del flujo de apoyo utilizado para transportar la muestra al Detector ELSD o al MS.
- Divisor de flujo, para desviar un pequeño volumen del flujo principal hacia el flujo de Make-Up
- Tubo de retención (delay loop) para conservar el flujo principal dentro del sistema hasta que el flujo desviado no llegue al detector para ser analizado. Básicamente es un tubo que enrollado en forma de bobina.
Cuando el ELSD o el MS detectan una muestra, se envía una señal al colector de fracciones para recoger la porción correspondiente del caudal principal.
El sistema completo (bomba Make-Up, MRA y Delay Loop) es voluminoso y los componentes del mismo son caros. El divisor también es ruidoso y poco agradable para el usuario. Debido al tamaño del sistema es complicado situarlo cerca del detector de masa, que sería la opción más deseable.
El impacto de la distancia entre el sistema y el MS y las longitudes resultantes de las canalizaciones es la causa de la generación de un volumen muerto que puede causar un ensanchamiento de los picos de los productos separados debido a la difusión.
La base de un sistema de Split Dinámico se basa en el MRA (Mass Rate Attenuator) de Rheodyne que está diseñado para HPLC y, por tanto, es capaz de soportar presiones sustancialmente superiores a las necesarias para las aplicaciones asociadas con purificación FLASH y LC-Prep. Además del coste elevado, requiere atenciones frecuentes y piezas de repuesto caras que afectan al usuario.
Una válvula MRA consiste básicamente en un motor paso a paso y su conexión mecánica, un rotor y un estator.
El rotor es un disco circular con tres pares de puertos fresados en tamaños variados en el lado plano, donde los puertos más pequeños pueden contener 22 nL (100 y 300 nL los otros puertos).
El estator también es un disco circular con dos pares de canales axialmente a través del disco. Los diámetros de los canales a través del estator para el Make-Up y el caudal principal son de 0,36 mm y 1 mm respectivamente (Figura 9).
El estator está fabricado probablemente con polietileno de alta densidad (HDPE), PTFE o nylon y el rotor de Polí Éter Éter Cetona (PEEK). Se aprietan ambos con una gran presión para evitar fugas entre los dos rotores para soportar la presión del flujo principal a niveles de HPLC.
La Figura 10 muestra un esquema del funcionamiento de una válvula MRA de Rheodyne:
El flujo principal de la columna se conduce a través de un par de puertos de entrada / salida y el flujo de Make-Up a través del otro par. El flujo principal, que transporta los eluidos, llena un bucle interno del rotor. El rotor gira de modo que el bucle se alinee con el flujo de Make-Up, lavándolo y aportando su contenido hacia el MS. La relación de división se puede establecer ajustando la frecuencia con que se gira el rotor y con una de las tres medidas de pozo utilizado.
Utilizando el pozo más pequeño (22 nl) y la frecuencia más alta del motor (2 Hz) se puede obtener un caudal de 44 nL/s (2,6 µl/min) de caudal principal desviado hacia el flujo de Make-Up (ver Figura 10).
El caudal principal se puede ajustar manualmente entre 12 y 100 ml/min lo que implica graves limitaciones en purificación FLASH, dependiendo de la aplicación y la columna.
El flujo de Make-Up se suele fijar a 600 µl/min. El desgaste del rotor y el estator requieren mantenimiento frecuente. Estas dos partes se presionan entre sí con una fuerza muy grande para soportar las altas presiones en HPLC.para y evitar fugas, que puede causar contaminación cruzada,
Las partículas de material de desgaste pueden obstruir los pozos y sobre todo los pequeños canales a través del estator. No hay posibilidad de una supervisión automática del estado del rotor y el estator. Además, la obstrucción es sólo visible a través de un microscopio debido al pequeño tamaño de los canales. Si el MRA no funciona correctamente, primero se notará un rendimiento bajo del MS, que puede causar pérdidas de productos debido a la ausencia de detección de eluidos por parte del MS (o ELSD).
Como se ha mencionado anteriormente, la dispersión de la muestra se produce en el tubo entre el MRA y el MS (o ELSD). En ausencia de dispersión, la muestra llegaría al MS como «alícuotas» de muestra dos veces por segundo (2 Hz). No sólo las concentraciones en estas aportaciones de muestra pueden ser demasiado elevadas para el MS, sino que también la detección del analito podría dar resultados engañosos debido a artefactos de muestreo.
Básicamente, el MS tiene una frecuencia de muestreo determinada, en este caso 2 Hz. Según el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon una señal o alícuota de muestra en este caso, se debe muestrear con una frecuencia de al menos el doble de la anchura de banda de la señal. Si la frecuencia de muestreo es demasiado baja, el resultado es que la medida es inferior a la realidad, o bien se puede perder la muestra completamente.
En los MSD utilizados en la mayoría de los sistemas de Purificación Flash o LC-Prep (CMS Advion) la frecuencia de muestreo corresponde a al menos dos muestras por cada alícuota de muestra. Visto que la frecuencia de división más alta es de 2 Hz y la frecuencia de muestreo más alta es de 2 Hz, la detección se basa en la alícuota de muestra del flujo principal que se dispersa en el flujo de Make-Up.
Además de las dispersiones en las canalizaciones entre el divisor y el MS, el diseño del MRA, es decir el lavado de los pozos, resulta en una cierta dilución de la sustancia transferida.
La MRA de Rheodyne es utilizada por la mayoría de fabricantes en sistemas Flash y LC-Prep (****age. **co, ***zen, **** zen, ****ent …). Si tenemos en cuenta que la MRA 100 de Rheodyne ya causa una pérdida de carga importante (aproximadamente entre 20-30 bar en caudales de 100-150 mL/ min) su uso comporta una limitación en el tamaño de la columna Flash (entre F0120 y F0220) o el diámetro de la columna preparativa (no más de 30 mm DI con partícula de 5 micras).
Sin embargo, Interchim ofrece equipos Flash, LC-Prep e Híbridos Flash / LC-Prep con MS y ELSD, con un divisor de tecnología propietaria. La técnica oculta dentro de este divisor es un secreto comercial y permite los altos caudales de las columnas FLASH (hasta F0800, mientras que el competidores no pueden superar F0220) y columnas LC Prep de gran diámetro (hasta 50 mm DI con partícula de 5 µm).
La unidad de división es un módulo independiente entre el instrumento y el MS o integrada con el Detector iELSD (Figura11).
La Figura 12 muestra los beneficios de la Tecnología Interchim con Split Dinámico sin pérdida de carga: el uso en serie de detectores UV-DAD, iELSD y MSD.
En el caso de Detección por ELSD el uso de splitters dinámicos no se utilizan (excepto en iELSD Interchim) por su coste y fuerte pérdida de carga y es usual el uso de splitters estáticos como ***son *** 2250, **chi ****Leris X2 o ****age ****era.
La empresa ***ers también ofrece un divisor pasivo destinado a ser utilizado en línea con cromatógrafos y un detector destructivo como MS. Sin embargo, tiene una limitación evidente debido a la flexibilidad limitada. El divisor está diseñado para intervalos reducidos de caudales. Para poder cubrir el intervalo de caudales actualmente especificados por el sistemas híbridos (especialmente PF 5.250 de Interchim), se necesitan hasta cuatro diferentes versiones del divisor de ***ers. Parece que la forma en que estos divisores dividen el flujo es un secreto corporativo, pero la guía del usuario da la impresión de que se utiliza un tubo de restricción de caudal para desviar una cierta cantidad del flujo.
Como MRA es el dispositivo dominante para la división de flujo en cromatógrafos LC del mercado, la empresa que encuentre una solución alternativa para reducir el coste asociado con el divisor, reducir su mantenimiento y disminuir la pérdida de carga obtendría una ventaja técnica y comercial respecto a otros fabricantes de Equipos Flash, LC-Prep e Híbridos Flash / LC-Prep.
Hoy esta empresa es Interchim-Advion.