Introducción

El aceite de oliva virgen contiene una gran variedad de compuestos fenólicos que resultan muy importantes para valorar la calidad del aceite tanto por sus características sensoriales como las que hacen referencia y a sus efectos saludables.

El aceite de oliva se obtiene de los frutos del olivo (Olea Europea) por procedimientos mecánicos, sin el auxilio de tratamiento térmico o químico alguno, y por sus beneficios nutricionales, el aceite de oliva virgen resultar ser una buena fuente de compuestos bioactivos con efectos protectivos de la salud.

Además de las altas cantidades de ácidos grasos mono y poliinsaturados, los antioxidantes más abundantes en el aceite de oliva son los fenoles hidrofílicos y lipofílicos que influyen tanto en las características organolépticas, lo protegen frente a la autooxidación^1,2 del aceite como en sus efectos sanitarios beneficiosos.

Los niveles de estos componentes bioactivos dependen de factores genéticos, ambientales y agrarios.

Los antioxidantes presentes en el aceite de oliva que influyen tanto en la calidad como en otros factores se pueden considerar los fenoles lipofílicos como los tocoferoles (Vitamina E), el escualeno, los fitosteroles, carotenoides y los fenoles hidrofílicos. Estos últimos incluyen ácidos y alcoholes fenólicos, flavonoides, catequizas y otros.

Las Figuras 1, 2, 3, 4 , 5 6 y 7, muestran algunos de los compuestos analizados en este estudio.

Fuentes

Loa ácidos fenólicos, como el vanillico, cinnámico y muchos otros, se encuentran en muchas plantas y resultan importantes en la calidad sensorial y del color.

Los acoholes fenólicos, como el hidroxitirosol y el tirosol, están presentes en el aceite virgen de oliva en cantidades relativamente bajas, pero su concentración aumenta durante el almacenamiento por la hidrólisis de los secoiridoides como la oleuperina y el ligstrósido que son relativamente abundantes en el aceite.

Los Flavonoides  Luteolina y Apigenina también están presentes en el aceite virgen de oliva.

La concentración de secoiridoides y lignanos, resultan considerablemente afectados por las condiciones agrícolas y el origen geográfico.

Método COI/T.20/Doc. No. 29, Noviembre 2009

El análisis del contenido de fenoles totales en aceite virgen de oliva según el protocolo operativo descrito por el Consejo Oleícola Internacional en Determinación de los Biofenoles de los Aceites de Olva Mediante HPLC  (COI/T.20/Doc. No. 29, Noviembre 2009)³. permite un rango de medida entre 30 mg/kg y 800 mg/kg. En función de las condiciones agronómicas el rango de fenoles totales oscila entre 100 y 500 mg/kg⁴ de aceite virgen de oliva. En aceites refinados las cantidades de biofenoles es considerablemente inferior.

1.1. Estándares Externos de Calibrado (A)

Tirosol 0.030 mg/mL y Ácido Siríngico 0.015 mg/mL en MeOH:H₂O 80:20 (V/V). Para la preparación ver COI/T.20/Doc. No. 29, Noviembre 2009.

Estos Estádares se utilizan para calcular la relación entre el Factor de Respuesta (FR) del Ácido Siríngico y Factor de Respuesta (FR) del Tirosol: RRF_sir/tir.

RRF_sir/tir = RF_1μg(Ácido Siríngico)/RF_1μg(Tirosol

Este valor ha de ser constante y comprendido en el intervalo 5.1±0.4 para poder expresar el resultado final como Tirosol, usando Ácido Siríngico como Patrón Interno (P.I.)

1.2. Estándar Interno (B)

Ácido Siríngico 0.015 mg/mL en MeOH:H₂O 80:20 (V/V). Para la preparación ver COI/T.20/Doc. No. 29, Noviembre 2009

1.3. Mezclas de Calibrado

Se preparó una mezcla de 17 compuestos de la composición siguiente (en orden de elución en las condiciones de análisis)

• Hidroxitirosol
• Tirosol
• Ácido p-Hidroxifenilacético
• Ácido Vanillico
• Ácido Siríngico
• Cianidin-3-glucósido
• Cianidin-3-rutinósido
• Vanillina
• Verboscoside
• Luteolin-7-glucósido
• Ácido p-Cumárico
• Ácido Ferúlico
• Ácido o-Cumárico
• Apigenin-7-glucósido
• Oleuropeína
• Ligstrósido
• Ácido Cinnámico

1.4. Solución de Extracción (C)

MeOH:H₂O 80:20 (V/V). Para la preparación ver COI/T.20/Doc. No. 29, Noviembre 2009

1.5. Procedimiento

• Pesar 2.0g de aceite de oliva en un tubo roscado de 10 mL y trasferir 1 mL de la solución (B).
• Agitar durante 30″
• Añadir 5 mL de la solución de extracción (C)
• Agitar durante 60″
• Extraer en baño de ultrasonidos durante 15′ a temperatura ambiente
• Centrifugar a 5.000 r.p.m. durante 25′
• Tomar una parte del sobrenadante y filtrar en jeringa con filtro de PVDF de 0.45 μm

1.6. Análisis HPLC Mezcla 17 Compuestos

Se siguieron las recomendaciones del COI excepto en el tipo de columna usado (Thermo Fisher Scientific GOLD C18, 250×4.6mm y 5 mm P/N 25005-254630) y la composición del Patrón Interno (Ácido p-Hidroxifenilacético): 0,015 mg/mL en metanol/agua 80/20 (V/V) . La columna seleccionada tiene una eficacia y robustez sensiblemente superior a la indicada en el método y ha permitido la realización de las determinaciones en un tiempo sensiblemente menor con una pequeña modificación del Método COI.

Se obtuvo el cromatograma siguiente:

1.7. Calculo del contenido en Biofenoles del Aceite de Oliva Virgen

El contenido en biofenoles (naturales o por oxidación de la oleuropeína, ligustrósido, lignanos, flavonoides y ácidos fenólicos) en mg/kg según la Fórmula siguiente:

donde

ΣA es la suma de las áreas de los picos de os fenoles (hidroxitirosol, tirosol, naturales o por oxidación de la oleuropeína, ligustrósido, lignanos, flavonoides y ácidos fenólicos) registrados a 280nm.

1000 es el factor usado para expresar los resultados en mg/kg

RRF_sir/tir es el factor multiplicador para expresar el resultado final como tirosol.

W_sir es el peso del ácido siríngico usado como P.I. e i mL de disolución añadida a la muestra.

A_sir es el área del P.I. ácido siríngico registrada a 280 nm.

W es el peso del aceite usado en gramos.

Los fenoles se identificaron por comparación de los cromatogramas resultantes de los estándares y de la lista del  Protocolo COI.

En el Método HPLC según COI todas las áreas de los picos con retención entre 10 y 52 minutos se suman.

En el Método HPLC modificado se suman todas las áreas de los picos con retención entre 6 y 42 minutos.

En Aceites de Oliva Vírgenes el contenido total de fenoles puede oscilar entre 200 y 700 mg/kg (dependiendo de factores genéticos, ambientales y agrarios), mientras que en aceites refinados este valor es substancialmente más bajo (<60 mg/kg).

Ver también esta entrada en el BLOG:

Análisis de Catequinas y Ácidos Fenólicos en Vino Tinto mediante Extracción en Fase Sólida y HPLC

Bibliografía

1. Beltrán et al., “Evaluation of virgin olive oil bitterness by total phenol content analysis”.  Eur. J. Lipid Sci. Technol. Volume 108, 193-197, 2007.
2. El Riachy et al., “Hydrophilic antioxidants in virgin olive oil. Part 1: Hydrophilic phenols: A key factor for virgin olive oil quality”.  Eur. J. Lipid Sci. Technol. Volume 113, 678-691, 2011.
3. International Olive Council: COI/T.20/DOC. 29 – 2009 –
   DETERMINATION OF BIOPHENOLS IN OLIVE OILS BY HPLC, 2009.
4. Owen et al., “Olive-oil consumption and health: the possible role of antioxidants”.  The Lancet  Oncology. Volume 1, 107-112, 2000.
5. Garcia et al., “Effect of refi ning on the phenolic composition of crude olive oils”. JAOCS Volume 83, No. 2, 159-164, 2006.