Aumente la sensibilidad de los compuestos con alto punto de ebullición
La amplia variedad de insertos de inyección disponibles para el cromatografista hace que la selección del tipo más adecuado para cada técnica sea, muchas veces, complicada,
Una elección equivocada puede afectar directamente un parámetro tan importante como la sensibilidad.
¿Qué es mas adecuado, un inserto recto, con lana de vidrio, con deflectores, de copa laminar, con estrechamientos…?
La eficacia del inserto para transferir calor del inyector depende de su diseño. En el momento de la inyección la zona en la que el solvente, todavía en fase líquida, inicia la vaporización tiene la máxima influencia en la discriminación por punto de ebullición de los componentes de la muestra antes de que lleguen a la columna. Otro factor que influye en la discriminación es la pérdida de volátiles por la parte superior del inserto, aunque este efecto no es tan importante como la transferencia inicial de energía del inserto o de la base metálica del inyector a la muestra.
Algunos insertos no transfieren esta energía tan efectivamente como otros y, por tanto, frenan el proceso de vaporización. Cuando una muestra líquida se inyecta mediante un inyector automático en el inserto, sale de la aguja de la jeringa a alta velocidad. En la mayoría de los casos, una parte pequeña de la muestra se nebuliza, pero el resto se mantiene unida hasta que choca contra una superficie.
Un inserto puede tener tres tipos de superficie en las que la muestra líquida puede iniciar la vaporización:
- lana de cuarzo
- vidrio (boro silicato o cuarzo)
- metal (generalmente acero inoxidable niquelado)
A la misma temperatura estos materiales tienen diferentes cantidades de energía y, por tanto, actúan diferentemente cuando la muestra inicia la vaporización usando parte de esta energía. Si se acepta que la masa de las superficies metálicas o de vidrio sean similares, la temperatura de la masa de vidrio no caerá tan rápidamente como la de la masa metálica cuando se utilice la misma cantidad de energía debido a las diferencias en capacidades térmicas (ver Figura 1).
Consideremos ahora el orden de vaporización.
Si 1 μL de 100 ppm de Hidrocarburos TRPH (Total Recoverable Petroleum Hydrocarbon, C8-C40) en cloruro de metileno se inyecta en SplitLess, tanto el solvente como los hidrocarburos absorberán energía aproximadamente a la misma velocidad. Sin embargo los compuestos con mayor punto de ebullición (>C18) necesitarán un poco más de tiempo para absorber la energía adicional necesaria para la vaporización.
El problema es que el 99,99% de la muestra es solvente volátil, que vaporizará antes con los compuestos más volátiles usando una gran cantidad de energía del inserto o de la junta inferior metálica (tal como muestra la Figura 1) que se enfriará.
Cuando los compuestos menos volátiles inicien la vaporización la base del inserto o del inyector ahora están mucho más frías que antes de la inyección. Según el volumen de la muestra, de la capacidad térmica específica del solvente y de las superficies de inyección, este enfriamiento puede afectar significativamente a la velocidad de evaporación de los compuestos menos volátiles. En pocas palabras, el C18 y otros hidrocarburos más pesados inician a evaporarse cuando la temperatura del material con el que están en contacto cae, frenando su evaporación. Esta situación no afecta los compuestos más volátiles puesto que éstos ya están en fase vapor.
Los resultados pueden verse en el gráfico siguiente donde se muestra que el área del C22 en in inserto recto (straight liner) es la mitad que la que se obtiene usando un inyector con estrechamiento inferior (tapered liner).
El primer inserto es menos eficiente al transferir la energía puesto que la base metálica del inyector se ha enfriado más rápidamente que el vidrio.
También influye el hecho de que el inyector no tiene una temperatura homogénea y la base del mismo suele estar a menor temperatura que la zona central, con lo que su base metálica no sólo se enfría más rápidamente sino que, además, está a una temperatura menor.
Aumente la sensibilidad de los compuestos con bajo punto de ebullición
La mayoría de los usuarios creen que para eliminar la discriminación de los compuestos volátiles resulta suficiente asegurar que el inserto tenga un volumen interno mayor que el volumen que ocupa la muestra tras la vaporización. Así se evita que los vapores de solvente y componentes de la muestra ocupen también las líneas de transferencia y purga del inyector además de parte del sistema neumático (efecto llamado flashback), que causan una contaminación del sistema difícil de eliminar.
En general esta regla resulta adecuada pero en muchos casos la regla opuesta también resulta cierta y el concepto de “flashback” no puede aplicarse realmente a todas las propiedades de los gases.
Cuando una muestra de líquido se expande en un inserto caliente provoca un rápido incremento de la presión en la zona donde la expansión se inicia. La presión se reduce al expandirse la muestra a otras áreas del inyector.
En modo SplitLess, si un solvente líquido se deposita cerca de la parte inferior del inserto se expansionará hacia la parte superior y puede que hasta las líneas de gas portador para compensar la presión. Si algún analito volátil se evapora al mismo tiempo que el solvente, también se expansionará hacia las líneas de portador y de purga, causando una discriminación por bajo punto de ebullición.
Si 1 μL de Cloruro de Metileno se expande a 400 μL, el vapor llenará el volumen disponible antes de ser eliminado por el portador (ver la Figura 3). La expansión de la muestra gaseosa en la zona superior del inserto resulta mayor puesto que la velocidad del gas portador es menor en esa zona.
En modo SplitLess, si la velocidad de inyección y los caudales del portador en el inyector son bajos, pueden aparecer problemas de pérdida de volátiles que también pueden suceder si la muestra vaporiza en la zona central del inserto donde la distancia hacia la zona superior del inserto es menor.
Si se ha de seleccionar un inserto para minimizar las pérdidas de las fracciones volátiles siga las recomendaciones siguientes:
- Zona de vaporización de la muestra
La discriminación de la fracción volátil ocurre muy a menudo con insertos que contengan lana de cuarzo o cualquier objeto que esté situado en la zona central del inserto. Cuando la muestra alcanza este punto, la mayor parte se retiene (depende del diseño del inserto) e inicia su evaporación. Es posible que parte de la fracción volátil escape por la parte superior del inyector puesto que no existe demasiada distancia que recorrer. Por lo tanto el inserto no ha de tener nada en la zona central, y es preferible que la lana de cuarzo o de vidrio esté situada en la parte inferior. (Ver Figura 4).
Figura 4. Diferentes geometrías de insertos. - La velocidad del gas portador a través del inserto
Para evitar que la muestra vaporizada migre hacia la parte superior del inserto se ha de aumentar la velocidad del gas portador. No es necesario aumentar la presión del gas para aumentar su velocidad lineal: se puede disminuir el diámetro interior del inserto para aumentar la velocidad lineal del gas. Seleccione un inserto con un estrechamiento en la parte superior o un menor diámetro y descarte los insertos rectos o con elevado diámetro interior (Vea la Figura 4).
El gráfico muestra los resultados obtenidos con un inserto de 1.2 mm de diámetro interior frente a otro de 4 mm con lana en la zona central al inyectar una muestra de hidrocarburos en pentano. El inserto de 1.2 mm permite una mayor sensibilidad para la fracción más volátil puesto que la muestra vaporiza en la parte inferior y la velocidad lineal del gas portador es superior que en el inserto de 4 mm. El inserto de 4 mm ofrece resultados opuestos: la muestra vaporiza en la zona central y la velocidad del gas portador es baja, aumentando la posibilidad que los compuestos de baja volatilidad alcancen la parte superior del inserto con la expansión inicial del solvente (ver Figura 5).
El mayor inconveniente al usar insertos de poco diámetro interior para evitar la discriminación de los volátiles es que pueden sobrecargare con facilidad.
Hasta una inyección de 1 μL puede sobrecargar el inserto si se selecciona el solvente inadecuado.
Una vía mejor para evitar este tipo de discriminación es usar insertos con estrechamiento en la parte superior. La velocidad del portador es mucho mayor a través del estrechamiento es mucho mayor que en el cuerpo del inserto, obligando que la fracción más volátil permanezca en el cuerpo del inyector. Los insertos con doble
estrechamiento (double tapered liners) permiten la menor discriminación de la fracción volátil. Un inserto con un solo estrechamiento en la parte superior (single tapered) es eficaz para mejorar la introducción de muestras volátiles, pero es menos eficaz con la fracción más pesada. Los insertos con menor diámetro son mejores, pero hay que prestar mucha atención a la inyección de muestras por encima de 1 μL.
El problema de la expansión del solvente (Flashback)
No todos los solventes expanden al mismo volumen bajo unas condiciones determinadas. Es importante recordar que el volumen del gas aumenta al disminuir el peso molecular. La sobrecarga del inserto o flashback sucede cuando el volumen del gas expandido es superior al volumen interno del inserto.
Éste es uno de los motivos por lo que el agua es un solvente muy difícil, puesto que puede expandirse hasta en cuatro veces más volumen que la misma cantidad de cloruro de metileno.
Un inserto con un diámetro interior de 4 mm y una longitud de 78.5 mm tiene un volumen de aproximadamente 1.0 mL. La inyección de 1 μL de cloruro de metileno a 250ºC y a una presión 0,8 bar ocupará un volumen de unos 380 μL, Como el inserto usado tiene un volumen interno de 1000 μL y el volumen que ocuparán los vapores de cloruro de metileno son de unos 380 μL inferiores se evitará el riesgo de Flashback.Sin embargo 1 μL de agua ocupa un volumen de 1400 μL en las mismas condiciones que, obviamente, es superior al volumen geométrico del inserto.
El vapor de agua se expansionará más allá del volumen del inserto y puede alcanzar las líneas de portador y de purga, con la posibilidad de que sea devuelto de nuevo al inyector y a la columna (Flashback), con la inmediata contaminación del sistema y, en el peor de los casos, a la substitución de parte del sistema neumático del instrumento.
El flashback aparece con mayor facilidad si se inyecta en SplitLess, pero existen varias posibilidades para evitar dicho efecto.
- Cambie el tipo de solvente
- Disminuya el volumen inyectado
- Use un inserto adecuado
Selección del Inserto
Inyección en Split (con división)
Seleccione preferiblemente insertos con lana de cuarzo, para :
- Mejor mezcla de los vapores de los analitos y una superior cuantificación
- Mayor superficie de contacto para mejorar la vaporización de muestras líquidas.
- La lana de cuarzo permite adsorber residuos no volátiles presentes en la muestra
- Evita que la muestra alcance el fondo del inyector antes de la vaporización.
Inyección en Split-Less (sin división)
Seleccione preferiblemente insertos con estrechamiento (gooseneck) en la zona inferior, para :
- Minimizar el contacto de los analitos con el fondo metálico del inyector. En Split-Less el tiempo de residencia de la muestra puede ser muy grande.
- El estrechamiento conduce la muestra hacia la columna: el posicionamiento de la columna en el inyector no es tan crítica.
Inyección en Split-Less (sin división) de compuestos activos
- Como en el punto anterior evitando lana de cuarzo o de vidrio
Inyección en Cromatografía Rápida en columnas de muy bajo diámetro interno
Seleccione preferiblemente insertos de muy bajo volumen
- Permite la creación de picos de menor anchura al aumentar la velocidad lineal del gas portador en el inyector.
Desactivación del Inserto
La superficie del vidrio de borosilicato es naturalmente ácida y contiene silanoles libres, silanoles hidratados o puentes siloxano. La desactivación permite bloquear dichos grupos con grupos funcionales no polares, creando una superficie más inerte.
Existen dos métodos de desactivación:
- Desactivación en Fase Líquida (vea ejemplo más adelante)
- Desactivación en Fase Gas a Alta Temperatura.
Seleccione insertos desactivados a alta temperatura si es posible (vea la Tabla I), pero si prefiere desactivar su inserto personalmente utilice el procedimiento recomendado más adelante.
Nunca limpie sus insertos con mezcla crómica: no sólo eliminará la desactivación superficial sino que, además, causará la aparición de zonas más activas.
¿Cada cuándo hay que sustituir el Inserto?
La respuesta más inmediata es en cuanto se deteriore la cuantificación o la forma del pico.
Algunos laboratorios que inyectan muestras muy sucias o con poco clean-up cambian diariamente el inserto, mientras que otros más cuidadosos o que trabajan con muestras muy limpias lo cambian semanalmente o mensualmente.
Es recomendable sustituir el inserto de una manera rutinaria al menos una vez al mes.
Aumente la frecuencia de la substitución en función de la limpieza y el número de muestras inyectadas.
Procedimiento de Desactivación Líquida
- Coloque el Inserto en un tubo roscado con un tapón con membrana teflonada.
- Manténgalo durante 8 h en una solución de HCl 1N. No aumente el tiempo más de 24 h. Si la solución resulta ligeramente coloreada, repita el tratamiento con solución ácida limpia.
- Saque el Inserto y lávelo con agua desionizada y metanol
- Seque el Inserto a 100-150ºC. Si el Inserto a sido lavado con ácido ha de ser silanizado antes de su uso.
- Ponga el Inserto limpio y seco en un tubo roscado con un tapón con membrana teflonada
- Cubra el inserto con una solución al 10% de trimetilclorosilano o dimetildiclorosilano en tolueno o hexano seco
- Cierre herméticamente el tubo
- Mantenga el inserto en la solución durante 8 h
- Saque el inserto de la solución silanizante y lávelo con tolueno (o hexano) y luego con metanol.
- Seque el inserto a 75-100ª durante 30 a 60 minutos.
- No manipule el inserto con las manos: use siempre guantes adecuados.
- El tratamiento requiere el uso de materiales corrosivos, irritantes y tóxicos. Manipúlelos con las precauciones necesarias.