Desarrollo de Métodos HILIC
Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) es uno de los enfoques con más éxito en la separación y retención de compuestos polares.
Existen muchas fases estacionarias que se pueden usar en condiciones HILIC y muchas se describen genéricamente como HILIC, independientemente de su química. También hay mucha desinformación sobre esta técnica y muchas cuestiones a resolver
- ¿Qué columna debería usarse?
- ¿Cuáles son las mejores condiciones iniciales para la fase móvil
- ¿Cuáles son los problemas comunes en el desarrollo de un método HILIC que tienen que resolverse?
Estas son las preguntas a las que se enfrentan los usuarios de HILIC y que necesitan respuesta.
¿Qué es HILIC?
HILIC puede describirse como una variante de la cromatografía de fase inversa efectuada con una fase estacionaria polar. La fase móvil utilizada es de naturaleza alta mente orgánica (> 60-70% solvente, generalmente acetonitrilo) que contiene un pequeño porcentaje de solvente/tampón acuoso u otro solvente polar. El agua de la fase móvil forma una capa acuosa adsorbida en la superficie polar de la fase estacionaria en la que particionan los analitos.
La ventaja principal de HILIC como técnica de separación es la fuerte retención de compuestos polares hidrofílicos que no son retenidos en condiciones normales de fase inversa, sin la necesidad de aditivos de par iónico en la fase móvil.
Mecanismos de Retención HILIC
Las evidencias sugieren que el mecanismo de retención HILIC es complejo y consiste en la combinación de:
- Reparto hidrofílico del analito entre la capa rica en agua y la fase móvil
- Enlace de hidrógeno entre los grupos funcionales polares y la fase estacionaria
- Interacciones electrostáticas con grupos funcionales ionizados
Además también pueden estar presentes interacciones de van der Waals entre las partes hidrofóbicas de los ligandos unidos a la fase estacionaria y la parte no polar de los analitos.
Desarrollo de un Método HILIC
Es recomendable un enfoque sistemático para desarrollar un método HILIC. Los parámetros del método han de considerarse y ajustarse de manera secuencial.
La siguiente secuencia resulta una buena base de partida:
- Determinar las propiedades del analito
- Seleccionar la fase estacionaria más apropiada
- Seleccionar las condiciones iniciales de fase móvil más adecuadas
- Optimizar la fase móvil
- Optimizar la geometría de columna
El Diagrama de Flujo siguiente muestra cómo desarrollar un Método HILIC:
Propiedades del Analito
Conocer las propiedades físico-químicas de un analito resulta esencial para seleccionar la columna HILIC más adecuada. La combinación de Log P, Log D y pKa ayudará en la selección de la Fase.
Generalmente se recomienda HILIC para compuestos con Log P negativos. Otro parámetro importante es el pKa (-log Ka): Ka indica la acidez de una molécula. Mayor es Ka, más débil es el ácido. Log D ofrece una buena indicación del estado de ionización de un compuesto en solución a un pH específico. Log D es más representativo del carácter hidrofóbico en condiciones tamponadas que el valor de Log P.
Para mayor información sobre el cálculo e implicaciones de log p y log D puede consultar el siguiente artículo.
Selección de columnas
Columnas HILIC de TIPO 1
Columnas con muy pocas interacciones de intercambio. En este grupo las columnas que muestran una mayor retención y una mayor selectividad para los compuestos utilizados como test son:
Las que muestran pequeña hidrofilicidad pero con buena selectividad son:
Columnas HILIC de TIPO 2
Columnas con interacciones de Intercambio Iónico. Los materiales basados en sílice cruda tienen fuerte capacidad de intercambio catiónico.
Accucore HILIC y Syncronis Silica tenen un mayor α (CH2), α (OH) y selectividad k que Hypersil GOLD Silica, debido a u tamaño de poro diferente, área superficiel y tecnología de partícula.
Hypersil GOLD HILIC muestra una cierta actividad de intercambio aniónico.
(NOTA: las columnas Trinity P2 de Modo Mixto tiene también interacción HILIC. Vea esta entrada en el Blog para más información).
La figura 4 muestra el posicionamiento de las varias fases HILIC de Thermo Scientific.
En el extremo derecho se posicionan las fases con mayor grado de hidrofilia que deberían seleccionarse para analitos muy polares. En este caso la fase más polar es Accucore Amide-150-HILIC o Syncronis HILIC.
Con analitos cargados es posible usar las propiedades de intercambio iónico como ventaja. Los materiales con propiedades de intercambio catiónico se posicionan por encima del eje de las X mientras que por debajo se muestran las que tienen propiedades de intercambio aniónico. Syncronis Silica es un material con considerable capacidad de intercambio catiónico y se recomienda para el análisis de compuestos básicos y no es el más adecuado para la retención de compuestos ácidos (excepto si se trata de mezclas de ácidos).
En el otro extremo, GOLD HILIC, que tiene fuerte capacidad de intercambio aniónico, resultará útil en la retención de ácidos y mostrará poca retención con bases.
Los materiales sin capacidad de intercambio, como Thermo Scientific™ Acclaim™ HILIC-10, Thermo Scientific™ Accucore™
Urea-HILIC, Syncronis HILIC y Accucore 150-Amide-HILIC resultan adecuados para analitos cargados y neutros y son particularmente útiles para separar mezclas de especies ácidas, básicas y neutras.
Otras Fases HILIC
Otras fases populares son:
- Fases tipo Diol, que muestran una elevada hidrofilicidad
- Fases tipo Aminopropil, especialmente en el análisis de carbohidratos. La naturaleza reactiva de la función amino puede causar adsorcion irreversible
- Fases tipo Ciano pero de aplicabilidad limitada debido a la baja retención de compuestos polares (los grupos ciano no tienen capacidad de enlace de hidrógeno y por lo tanto son poco hidrofílicos)
Consideraciones sobre la Fase Móvil
En HILIC la fase móvil es altamente orgánica (generalmente un 60-70% de Acetonitrilo o más). Además de la selectividad de la columna la relación entre el la fase orgánica y el modificador acuoso es el factor principal que controla la retención. Un aumento en el porcentaje de fase orgánica produce un incremento en la retención si la concentración de acetonitrilo está entre el 60 y 90%. Si es inferior al 60% el incremento de retención es bastante menor
Acclaim HILIC-10, Acclaim Mixed Mode HILIC-1 e Hypercarb, como se ve en la Figura 5, muestran características de retención tanto HILIC como de fase inversa, en función del porcentaje de solvente orgánico en la fase móvil.
Cuando la concentración de Uracilo está entre 60−90%, la retención aumenta al aumentar el porcentaje de acetonitrilo (modo HILIC); entre un 5−30% de acetonitrilo, la retención disminuye al aumentar la concentración de acetonitrilo (comportamiento de fase inversa). Curiosamente, Acclaim Mixed Mode HILIC-1 no retiene el uracilo si el porcentaje de acetonitrilo está entre 30−80.
El uso de tampones volátiles como el formiato amónico o el acetato amónico se recomienda para:
- Mantener una buen forma de pico
- Controlar la retención de analitos cargados
- Asegurar la compatibilidad con detección MS
Tipo de Solvente Orgánico
Aunque el solvente más popular en HILIC es el acetonitrilo, se pueden usar otros solventes polares miscibles con agua. La fuerza elutrópica es, en general, la contraria a la observada en fase inversa. La fuerza relativa del solvente se muestra en la Tabla 1.
Aunque en HILIC se recomienda el uso de solventes apróticos, se ha demostrados que los alcoholes se pueden usar como el eluyente débil, pese que en general causan una disminución de la fuerza del reparto. Las interacciones de enlace de hidrógeno con las moléculas de agua causan una competencia en la solvatación de la fase HILIC provocando una menor retención.
En algunos casos en que analitos polares débiles podría precipitar en fases móviles acuosas se pueden usar solventes próticos en substitución del agua (esta técnica se conoce como «HILIC no acuosa»).
Tal como se muestra en el Diagrama de Flujo de la Figura 2, la fase móvil inicial sugerida es 80:20 Acetonitrilo/Tampón acuoso con el ajuste de la fuerza euyente si se alcanza una retención aceptable.
Como alternativa se puede utilizar un gradiente empezando con 95% de acetonitrilo, con dos minutos iniciales (o más en función de la longitud de la columna para establecer qué compuestos se retienen débilmente en modo HILIC) e incrementando gradualmente el porcentaje de tampón acuoso hasta un 40% en 15 minutos (columna de 100mm), con dos minutos finales, para establecer qué compuestos se retienen fuertemente en modo HILIC.
Con gradiente es importante tener una etapa de reequilibrado lo suficientemente larga para permitir que el volumen de capa acuosa se restablezca a sus condiciones iniciales. Se recomienda, al menos 20 CV.
La Figura 6 muestra el efecto de un tiempo de reequilibrado demasiado corto.
¿Necesito un tampón?
Como una regla general se añaden tampones a la fase móvil para reducir tanto la cola de los picos y/o la retención de analitos cargados. Inicialmente se demostró que la ausencia de sales tampón originaba tiempos de retención excesivos y picos muy anchos en columnas basadas en amida, ciclodextrina, ciano y amino.
Dada la buena solubilidad en solventes orgánicos, los tampones recomendados en HILIC son las sales amónicas de ácido fórmico y acético, que además son volátiles y adecuadas en LCMS o detectores CAD. Otras sales con relativa alta solubilidad en orgánicos son sales de bicarbonatos, perclorato de sodio y fosfatos de trietilamina, aunque las dos últimas no son compatibles con MS.
En general en HILIC se deberán evitar la mayoría de los tampones usados en Fase Inversa debido a su baja solubilidad en fases orgánicas altamente orgánicas.
Las fases estacionarias cargadas positiva o negativamente requieren mayores concentraciones de tampones que las fases neutras o zwitteriónicas.
La presencia de tampones en la fase móvil puede reducir las interacciones electrostáticas de atracción o repulsión entre analitos polares cargados (en las condiciones de pH de la fase móvil) que contribuyen significativa en la retención HILIC.
En condiciones de gradiente es recomendable añadir tampón en ambas fases móviles para mantener una fuerza tampón constante: si la fase Móvil A es 100% tampón acuoso y la B es 95% ACN y 5% tampón acuoso, es conveniente preparar ambas añadiendo un 5% de tampón acuoso concentrado (no más de 10 mM para evitar cristalización al ser añadida al ACN) tanto al agua como al Acetonitrilo.
pH Tampón Fase Móvil
Los compuestos cargados son más hidrofílicos resultan más retenidos en HILIC (ver Figura 7).
El ácido acetilsalicílico tiene un pKa de 3.5. Al aumentar el pH entre 4-6.5 el ácido se desproptona y se retiene más y viceversa.
El estado de carga de la fase estacionaria también puede afectar la retención HILIC de compuestos ionizables. La retención de citosina en una columna amino depende del pH. Cuando el pH del tampón se acerca al pKa (4.6) de la citosina, ésta se carga positivamente y se crea una repulsión electrostática con los grupos amino de la fase también cargados positivamente con una consiguiente pérdida de retención.
El pH del Tampón de la fase móvil también puede afectar el estado de carga de la fase estacionaria (ver Figura 8). En las fases basadas en sílice cruda la ionización de los grupos silanol depende del pH de la fase móvil. A pH>4-5 los silanoles están deprotonados y la superficie de la sílice está cargada negativamente. Si el analito está cargado positivamente la retención aumentará. La figura muestra como la retención de la citidina aumenta al aumentar el pH de 3.3 a 6.4 y al aumentar al mismo tiempo la proporción de silanoles deprotonados y la atracción con el analito cargado positivamente.
Es muy importante ajustar muy bien el pH del tampón de la fase móvil con fases basadas en sílice cruda y analitos básicos, para evitar tiempos de retención excesivamente largos o ensanchamiento de los picos.
Tipo y Concentración del Tampón de la Fase Móvil
El formiato amónico produce tiempos de retención mayores con compuesto ácidos en una fase amino debido a la débil fuerza eluyente del ión formiato durante la interacción de intercambio mientras que el acetato amónico tiene un mayor efecto neutralizante de las atracciones electrostáticas entre la superficie de la fase estacionaria cargada positivamente y el ácido con carga negativa.
Ambos, sin embargo, no ofrecen diferencia en retención con compuestos básicos en la misma columna amino ni en fases neutras o zwitteriónicas.
Cuando prevalecen las atracciones electrostáticas un aumento en la concentración de la sal produce una disminución de la retención de solutos cargados en fases estacionarias de carga opuesta. En la Figura 9 y 10 se muestra como la retención del ácido salicílico (cargado negativamente) en una fase GOLD HILIC (cargada positivamente) disminuye al aumentar la concentración del tampón.
De la figura anterior se deduce también que el aumento de la concentración de sal produce picos más estrechos.
Con fases estacionarias con la misma carga que el soluto el aumento de la concentración de sal produce un aumento de retención. La Figura 11 muestra que la citosina y la citidina se retienen más en una fase de intercambio de aniónico (GOLD HILIC) al aumentar la concentración de sal.
Recomendaciones en la selección de la Fase Móvil en HILIC
- Usar Acetonitrilo u otros modificadores orgánicos miscibles con agua. La fuerza elutrópica es inversa a la observada en Fase Inversa: los solventes apróticos causan mayor retención que los próticos.
- Mantener una alta concentración de orgánico entre el 60 y el 97%: se requiere un mínimo del 3% de agua para asegurar la hidratación de la fase estacionaria.
- Un aumento de orgánico produce un aumento de la retención.
- Usar sales como acetato o formiato amónico para evitar picos con cola y controlar la retención e analitos cargados.
- Las concentraciones de sales deberían estar entre 2-20 mM, aunque 20 mM sólo se recomienda si la concentración de orgánico está por debajo del 90%. Concentraciones mayores pueden ser insolubles o no ser adecuadas para detectores MS o CAD.
- En gradiente tamponar ambas fases. No efectuar gradientes de tampón.
- No efectuar gradientes de 100% orgánico a 100% acuoso.
- El estado de carga de la fase estacionaria puede afectar la retención HILIC de compuestos ionizables, en función del pH de la fase móvil.
Geometría de la Columna
Si el detector es UV, como una recomendación general, en métodos HILIC estándar, seleccione columnas de 100 o 150mm, 4.6 mm D.I. y partículas de 3 o 5 μm.
Si el detector es CAD o MS es mejor una columna más pequeña (100 o 50mm y 2.1mm D.I.) y partículas de 3 o 5 μm. El uso de una columna corta ha de decidirse tras haber considerado la complejidad de la muestra y la selectividad del detector.
Si es necesaria una mayor eficacia seleccione columnas con partículas por debajo de 2 μm o fases de núcleo sólido o columnas más largas.
Aunque hay diferencias debido a la cinética del analito y la fase estacionaria, para columnas equivalentes en dimensiones y tamaño de partícula, las columnas HILIC se operan a caudales similares o ligeramente inferiores a los usados en fase inversa.