Columnas HILIC
Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) es uno de los enfoques con más éxito en la separación y retención de compuestos polares.
Existen muchas fases estacionarias que se pueden usar en condiciones HILIC y muchas se describen genéricamente como HILIC, independientemente de su química. También hay mucha desinformación sobre esta técnica y muchas cuestiones a resolver
- ¿Qué columna debería usarse?
- ¿Cuáles son las mejores condiciones iniciales para la fase móvil
- ¿Cuáles son los problemas comunes en el desarrollo de un método HILIC que tienen que resolverse?
Estas son las preguntas a las que se enfrentan los usuarios de HILIC y que necesitan respuesta.
Fases estacionarias
Entender los posibles mecanismos de retención para un sistema particular columna-solvente-analito resulta crucial en la selección de la fase estacionaria HILIC más adecuada en la obtención de resultados con éxito.
Las fases estacionarias usadas en HILIC son bastante diversas y los usuarios a menudo creen de las “Columnas HILIC” son intercambiables.
Las fases estacionarias usadas en HILIC deberían caracterizarse por:
- Grado de hidrofilicidad
- Selectividad frente grupos hidrofílicos-hidrofóbicos
- Selectividad frente a isómeros posicionales y conformacionales
- Grado de interacción electrostática
- Naturaleza Ácido-Base de la fase estacionaria
Selección de Columnas
Para obtener una retención óptima de analitos polares es importante ajustar el valor log P o log D del analito al grado de polaridad de las fases HILIC.
Consideremos lo siguiente: Los compuestos hidrofílicos tienen mayor solubilidad en agua que en solventes orgánicos, o son completamente insolubles en solventes orgánicos (acetonitrilo, etanol, hexano…). Como ejemplo se pueden citar aminoácidos, azúcares, péptidos, nucleótidos, aminas protonadas y cualquier otra molécula con uno o más grupos funcionales polares (ver Figura 1), aunque no todos hacen que la molécula sea hidrofílica.
La presencia de algunos grupos funcionales (ver Figura 2) no hace que una molécula sea especialmente polar en términos de interacción hidrofóbica en cromatografía líquida. Una caracterización más objetiva de las propiedades hidrofílicas/hidrofóbicas de una molécula se define como log P (log D también se usa con la misma finalidad).
¿Qué es log P?
El coeficiente de reparto de una sustancia es un cociente o proporción entre las concentraciones de un compuesto no-ionizado entre los dos disolventes (normalmente Octanol y Agua). Para medir el coeficiente de reparto de solutos ionizables, el pH de la fase acuosa se ajusta de tal modo que la forma predominante del compuesto esté en la forma no-ionizada. El logaritmo del cociente entre las concentraciones del soluto no-ionizado en los disolventes se llama log P y se presenta en forma logarítmica porque el rango de valores que puede tomar es muy amplio:
Log P es un factor que representa las propiedades polares de una molécula. Mayor es su valor, más hidrofóbicos resulta el compuesto. En general productos con log P>1 resultan adecuados para cromatografía de fase inversa y pueden ser llamados hidrofóbicos (ver Figura 3).
¿Qué es log D?
El coeficiente de distribución es el cociente o razón de la suma de las concentraciones de todas las formas del compuesto (ionizada y no-ionizadas) en cada una de las dos fases. Para poder medir el coeficiente de distribución, el pH de la fase acuosa está tamponado a un valor específico de tal manera que el pH no varíe de modo significativo por la introducción del compuesto. El logaritmo del cociente entre la suma de las concentraciones de todas las formas del compuesto (ionizadas y no-ionizadas) en un disolvente, y la suma de las concentraciones de todas sus formas en el otro disolvente se llama log D y se presenta en forma logarítmica porque el rango de valores que puede tomar es muy amplio:
Además, log D es pH dependiente, por tanto, se debe especificar a qué pH se ha medido. De particular interés es el cálculo de log D para pH = 7.4 (el pH fisiológico del suero sanguíneo). Para un compuesto no ionizable, log P = log D para cualquier pH.
Para mayor información sobre el cálculo e implicaciones de log p y log D puede consultar el siguiente artículo.
La Figura 4 ilustra la hidrofilicidad relativa y las propiedades de intercambio iónico de las columnas HILIC de Thermo Scientific, y puede ser usada como una guía preliminar en la selección de la Fase Estacionaria.
Selectividad HILIC
Las características de las Fases Estacionarias pueden mostrarse en gráficos radar 2-D, ver Figura 5, que permiten una evaluación visual simple y la comparación de la selectividad de la columna. Cada eje del grafico radar representa uno de los parámetros siguientes:
- α (CH2) – Grado de Hidrofobicidad (tolueno, uridina y 5-metiluridina)
- α (OH) – Grado de Hidrofilicidad (tolueno, uridina y 2’-deoxiuridina)
- α (V/A) – Factor de Separación para Isómeros configuracionales (tolueno, adenosina y vidarabina)
- α (2dG/3dG) – Factor de Separación para Isómeros Posicionales (tolueno, 2’-deoxiguanosina y 3’- deoxiguanosina)
- α (AX) – Grado de Interacciones de Intercambio Aniónico (tolueno, uracilo y p-toluensulfonato sódico)
- α (CX) – Grado de Interacciones de Intercambio Catiónico (tolueno, uracilo y cloruro de N,N,N-trimetilfenilamonio)
- α (Tb/Tp) – Naturaleza ácido-báse de la fase (tolueno, teobromina, y teofilina)
- k U – Retención Absoluta
Figura 5. Los gráficos Radar 2-D permiten una evaluación visual simple y la comparación de las selectividades de las columnas.
Nota: Un valor de selectividad de 1 corresponde a ausencia de separación (puesto α= k2/k1, α= 1 cuando k1= k2).
Columnas HILIC Thermo Scientific
El nivel de las interacciones de intercambio iónico influye significativamente en la forma de los gráficos de radar para cada fase estacionaria, permitiendo la separación de las columnas HILIC de Thermo Scientific en dos grupos principales:
Columnas HILIC de TIPO 1
Columnas con muy pocas interacciones de intercambio. En este grupo las columnas que muestran una mayor retención y una mayor selectividad para los compuestos utilizados como test son:
Las que muestran pequeña hidrofilicidad pero con buena selectividad son:
Syncronis HILIC
Las columnas Thermo Scientific™ Syncronis™ HILIC permiten una mayor retención de compuestos polares cargados y neutros. Con esta fase se obtiene una excelente sensibilidad y forma de pico.
La fase estacionaria Syncronis HILIC tiene un grupo funcional zwitteriónico de tipo sulfobetaina, ver Figura 6, enlazado monoméricamente a una sílice altamente pura y de elevada área superficial.
El zwitterión sulfobetaína tiene grupos positivos (amonio cuaternario) y negativos (ácido sulfónico) en proporción 1:1, de tal manera que la carga superficial neta es cero. Gracias a fuerzas electrostáticas que se compensan permitiendo interacciones electrostáticas secundarias más débiles con el analito, las concentraciones de tampón necesarias para interrumpir esas interacciones son menores. La densidad de carga de esta fase depende del pH y la optimización del pH de la fase móvil depende únicamente del analito. Ver Figura 7.
Accucore™ 150 Amide HILIC
Las fases Amida ofrecen una fuerte interacción de enlace de hidrógeno entre la fase estacionaria y los analitos, con el resultado de una selectividad única en comparación con otras fases HILIC.
La combinación de un tamaño de poro grande y partículas de núcleo sólido permite que la columna Thermo Scientific™ Accucore™ 150-Amide-HILIC resulte muy adecuada en la separación de moléculas hidrofílicas, inclusive carbohidratos y péptidos, ver Figura 8.
La columna Accucore 150-Amide-HILIC resulta excelente en las separaciones de glicanos. Ver Figura 9.
Columna: Accucore 150-Amide-HILIC, 2.6µm, 100 x 2.1mm. Código: 16726-102130 . Fase Móvil: A) ACN B) 50mM ForNH4 (pH 4.5). Gradiente 20% B a 40% B en 40’, 40% B 5’, 20% B 0.5’, 20% B 50’. Caudal: 500µL/min Presión: 110bar Temperatura: 60°C Inyección: 2µL, 5µL Detector: FLEra 300nm, Era 420nm
Accucore™ Urea HILIC
La fase urea ligada a partículas de núcleo sólido permite una selectividad única para analitos polares. La columna Thermo Scientific™ Accucore™ Urea-HILIC ofrece buena retención de compuestos neutros y cargados.
La fase urea, ver Figura 10, ligada a partículas de núcleo sólido permite una selectividad única para analitos polares. La columna Thermo Scientific™ Accucore™ Urea-HILIC ofrece buena retención de compuestos neutros y cargados, ver Figura 11.
Fase Móvil: A) Agua B) ACN C) 100mM AcNH4 pH 4.9. Composición 10:80:10, A:B:C Caudal: 300µL/min Tiempo análisis: 2 minutos Temperatura: 35°C Inyección: 2µL Detection: UV a 230nm Presión: 71bar
Acclaim™ HILIC-10
Las columnas Thermo Scientific™ Acclaim™ HILIC-10 se basan en sílice totalmente porosa de alta pureza modificada con una capa hidrofílica propietaria. Las propiedades de intercambio catiónico identificadas en este material se deben a la presencia de grupos silanol deprotonados residuales (bajo las condiciones de pH de la fase móvil usada para el test de caracterización). Acclaim HILIC-10 ofrece buena retención de compuestos neutros y cargados.
Esta fase muestra un comportamiento frente a la retención dual, con un perfil de retención “en forma de U” en función del contenido de Acetonitrilo de la fase móvil, ver Figura 14. Se constata un aumento de retención tanto a altos como a bajos niveles de acetonitrilo (modos RP e HILIC respectivamente).
Hypercarb
El carbon poroso grafitizado (PGC), Hypercarb, permite mecanismos de separación únicos, basados en la combinación de interacciones dispersivas del analito y fase móvil y analito y la superficie grafitizada además de interacciones de carga inducida de los analitos polares con la superficie polarizable del grafito (ver figura 13).
Como consecuencia de estas interacciones combinadas los materiales PGC pueden retener analitos polares, tanto en condiciones típicas de fase inversa como en condiciones HILIC.
Como se muestra en la Figura 14, a concentraciones de acetonitrilo entre 90-60% la retención aumenta al aumentar el porcentaje de acetonitrilo (comportamiento HILIC); entre 10–60% de acetonitrilo, la retención disminuye al aumentar la concentración de acetonitrilo (comportamiento de fase inversa).
Acclaim MM HILIC 1
La columna Acclaim™ Mixed-Mode HILIC-1 usa una fase única basada en sílice de alta pureza que combina las propiedades de Fase Reversa (RP) y de Cromatografía Líquida de Interacción Hidrofílica (HILIC) gracias a una cadena alquílica hidrofóbica y una funcionalidad hidrofílica tipo diol. Esta combinación permite interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas que pueden ser utilizadas para optimizar separaciones, ver Figura 15.
Columnas HILIC de TIPO 2
Columnas con interacciones de Intercambio Iónico. Los materiales basados en sílice cruda tienen fuerte capacidad de intercambio catiónico. Accucore HILIC y Syncronis Silica tenen un mayor α (CH2), α (OH) y selectividad k que Hypersil GOLD Silica, debido a u tamaño de poro diferente, área superficiel y tecnología de partícula.
Hypersil GOLD HILIC muestra una cierta actividad de intercambio aniónico.
Hypersil GOLD™ Silica
Además de ser el soporte básico de todas las fases Hypersil GOLD, las columnas Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ Silica tienen muchas aplicaciones en tanto condiciones HILIC y de Fase Normal. Las propiedades de intercambio catiónico identificadas en este material se deben a la presencia de grupos silanol deprotonados (bajo las condiciones de pH de la fase móvil usada para el test de caracterización).
Se recomienda Hypersil GOLD Silica para el análisis de compuestos polares neutros o básicos.
Este material de sílice cruda ofrece una buena selectividad hidrofílica y una cierta selectividad isomérica. Esta fase ácida muestra una fuerte capacidad de intercambio iónico.
Syncronis™ Silica
Las columnas Thermo Scientific™ Syncronis™ Silica se basan en un soporte de alta pureza y de elevada área superficial (Poro 100 Å, 320 m2/g).
Syncronis™ Silica permite la separación de compuestos neutros o compuestos ácidos moderadamente polares tanto en HILIC como en modo Fase Normal. Las propiedades de intercambio catiónico identificadas en este material se deben a la presencia de grupos silanos deprotonados (bajo las condiciones de pH de la fase móvil usada para el test de caracterización), ver figura 16.
Accucore™ HILIC
Las propiedades de intercambio catiónico de este material se deben a la presencia de silanoles deprotonados (bajo las condiciones de pH de la fase móvil usada para el test de caracterización).
Thermo Scientific™ Accucore™ HILIC se recomienda para el análisis de compuestos polares neutros o básicos, ver figura 17.
Hypersil GOLD™ HILIC
Las columnas Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ HILIC se recomiendan para el análisis de compuestos polares ácidos o neutros.
