La Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC) utiliza una fase estacionaria con ligandos superficiales cargados que interaccionan con analitos de carga opuesta. La técnica se divide entre Intercambio Aniónico en la que los ligandos cargados positivamente de la fase estacionaria interaccionan con analitos cargados negativamente, e Intercambio Catiónico en la que la fase estacionaria con ligandos cargados negativamente interaccionan con analitos con carga positiva.
Método de Gradiente de Sal
En Cromatografía de Intercambio Iónico pasada en gradiente de sal se mantienen fijo el pH del tampón. El pH se del tampón inicial se selecciona de tal modo que se mantenga baja la fuerza iónica inicial puesto que en IEC la afinidad de las proteínas frente a las resinas (fase estacionaria) disminuye al aumentar la fuerza iónica.
Las proteínas se eluyen incrementando la fuerza iónica (concentración de sal) del tampón para aumentar la competencia entre los iones del tampón y los de las proteínas por los grupos de la resina de intercambio. Como resultado la interacción entre la resina y las proteínas se reduce, permitiendo que éstas eluyan.
El pI (punto isoeléctrico) de la mayoría de los anticuerpos está en la región de pH entre 6-10. Éste es el motivo por el que la IEC es el método normalmente utilizado para la separación de variantes cargadas de mAbs. La gama de columnas de intercambio como la familia MabPac SCX-10 ha sido específicamente diseñada para la separación de variantes de mAbs y otras especias afectadas por la carga como las variantes de truncamiento de lisina.
Método de Gradiente de pH
En Cromatografía de Intercambio Iónico pasada en gradiente de pH, el tampón inicial se mantienen a pH constante para asegurar que las proteínas tienen una carga opuesta a la fase estacionaria, por lo tanto uniéndose a la columna. Al efectuar el gradiente el pH del tampón cambia de tal manera quelas proteínas transiciones a una carga neta cero (el valor de pI) y finalmente la misma carga que la resina de tal manera que puedan eluir de la columna.
Las separaciones por Cromatografía Iónica de mAbs por gradiente de pH ofrecen la ventaja, frente al gradiente de sal, de un enfoque más genérico que permite un gran ahorro de tiempo en la etapa de desarrollo de métodos.
El reto principal en las separaciones con gradiente de pH consiste en la elección de un sistema tampón que pueda cubrir un amplio rango de pH con un gradiente lineal. Thermo Scientific ofrece un nuevo método para Cromatografía de Intercambio Catiónico basado en un sistema tampón multi-componente zwitteriónico en el que el gradiente lineal puede iniciar en 100% A (tanpón de bajo pH) a 100% B (Tampón de alto pH).
La linealidad del gradiente de pH se puede verificar con un equipo Thermo Scientific™ Dionex™ Ultimate™ PCM-3000 pH detector de conductividad. Una vez establecido el rango de pH aproximado de elución en una separación previa, se optimiza el proceso efectuando un gradiente menos extremo en un rango de pH más estrecho.
El ejemplo muestra la separación de variantes de avastina y bevacizumab con gradiente de pH: cuando se aplica un gradiente amplio de gradiente de 0% a 100% de B (pH 5.6 a 10.2), todas las variantes se eluyen en el rango de pH entre 7.0 y 8.0. Ver Figura 3 Caso A.
Si se ajusta el gradiente de 0% a 50% de B (pH 5.6 a 7.9), ver Figura 3 Caso B, la resolución se mejora con muy pocas etapas de optimización.
Un gradiente de sal en las mismas condiciones , ver Figura 3 Caso C y D, genera menor resolución.
Para incrementar la velocidad de análisis se puede usar una columna MAbPac SCX-10 RS de 5 μm con un equipo biocompatible Thermo Scientific™ Vanquish™ UHPLC adecuado para el análisis de proteínas intactas.
El ejemplo muestra como el bajo volumen muerto y la elevada precisión del gradiente permite la separación ultra-rápida de variantes de infliximab con un gradiente de pH y una columna MAbPac SCX-10 de 50 x 2.1mm.
La linearidad del gradiente de pH se puede verificar con el detector de conductividad y pH UltiMate 3000 que puede añadirse al sistema UltiMate 3000 BioRS, formando un equipo muy valioso en el desarrollo de métodos especialmente en las separaciones de proteínas y ácidos nucleicos. El detector permite el control de la formación de gradiente, equilibrado de columna y la comprensión los efectos del tamponado de la columna en cromatografía de intercambio con gradiente de pH.
El control del pH del eluyente durante un gradiente de pH permite caracterizar de manera más simple y predecible las variantes de carga puesto que las proteínas eluirán sólo cuando el pH está por encima el pI de las biomoléculas.
Los valores de pH para seis picos de proteína (lentil lectina-1, lectina-2, lectina-3, tripsinogeno. ribonucleasa A y citocromo C) muestran una gran correlación lineal con los valores de pI de la literatura, demostrando que el pI de una proteína puede estimarse con el tiempo de retención y el pH medido.
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Más Información
Visite las siguientes entradas si desea más información sobre las nuevas columnas para biocromatografía de Thermo Scientific:
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- Separación de Agregados por Cromatografía de Exclusión (SEC)
- Análisis de Variantes de Carga por Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC)
- Análisis de Variantes por Oxidación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)
- Análisis de Conjugados Anticuerpo-Droga (ADC) por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) y de Fase Inversa (RP)
- Análisis de mAB’s Intactos y Fragmentos de mAb’s por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
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