La presencia y relativa abundancia de las diferentes glicoformas así como la determinación correcta de la secuencia de la proteína resulta imprescindibles para verificar las especificaciones o los requerimientos de calidad de la molécula completa y asegurar que los efectos biológicos de la droga sean seguros y reproducibles.La manera más simple es el uso combinada de Cromatografía de Fase Inversa (RPC Reverse Phase Chromatography) acoplada a detección por MS/MS. En general los mAb’s se analizan en su forma nativa intacta, en forma de cadena ligera o pesada o tras rotura enzimática del Fragmento de Enlace Antigénico (Fab) o Fragmento Cristralizable (Fc).
El método de separación por RPC ofrece elevada selectividad basada en la hidrofobicidad de la molécula y es una alternativa a los métodos por intercambio con separaciones ortogonales de alta resolución.
La columna Thermo Scientific MAbPac RP usa una resina supermacroporosa de poro ancho y elevada capacidad de carga. Ambas características resultan ideales en el análisis de anticuerpos teniendo en cuenta el gran tamaño de la proteína (normalmente de unos 150 kDa). La Figura 1 muestra las excelentes prestaciones de MAbPac RP en el análisis de fragmentos de trastuzumab: se separan a línea de base LC, HC, Fc, Fab, scFc (Single Chain FC) y F(ab’)2 (fragment, antigen-binding, including hinge region (both arms) con un gradiente de 10 minutos (ver Figura 2).
La confirmación de la masa precisa del producto objetivo y de sus variantes se realiza por RPC acoplada a Espectrometría de Masas de Alta Resolución (HRMS). En el ejemplo mostrado en la Figura 3 se utiliza un Espectrómetro de Masas Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus hybrid quadrupole-Orbitrap. El registro superior muestra el TIC (Total Ion current) y el último el Espectro de Masas.
Se obtiene más información estructural por reducción de trastuzumab en fragmentos de cadena ligera y pesada. La figura 4 muestra la identificación de las diferentes glicoformas de la cadena pesada.
La oxidación con metionina (Met) es uno de los atributos de calidad críticos que hay que controlar estrechamente. Se ha hallado que los dos resíduos Met en el dominio CH2-CH3 de anticuerpos recombinantes IgG1 humanizados y totalmente humanos resultan susceptibles a procesos de oxidación. Resulta, pues, conveniente el control del progreso de la oxidación Met sin la completa digestión del mAb.
Normalmente se efectúa una reducción inicial del mAb y una sucesiva con IdeS para producir fragmentos menores (25 kDa).
Una nueva digestión con IdeS de la cadena HC produce dos fragmentos menores: scFc y Fd’. La columna MAcPac RP separa a línea de base tanto scFc como LC y fragmentos Fd’ como se muestra debajo. El estado de carga +10 de los scFc oxidados y no oxidados se produce a m/z 2525.60 y 2524.08. Ver Figura 5.
La Figura 6 muestra la resolución isotópca de scFc oxidado y no oxidado en un estado +16 de carga a una resolución de 280K .
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Más Información
Visite las siguientes entradas si desea más información sobre las nuevas columnas para biocromatografía de Thermo Scientific:
- Determinación de la Concentración de mAb por Cromatografía de Afinidad)
- Separación de Agregados por Cromatografía de Exclusión (SEC)
- Análisis de Variantes de Carga por Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC)
- Análisis de Variantes por Oxidación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)
- Análisis de Conjugados Anticuerpo-Droga (ADC) por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) y de Fase Inversa (RP)
- Análisis de mAB’s Intactos y Fragmentos de mAb’s por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
- Mapa de Péptidos por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
- Análisis de Glicanos por Cromatografía de Modo Mixto (MMC) y Cromatografía de Interacción Hidrofílica (HILIC)
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