Los ADCs han generado un tremendo interés entre las compañías farmacéuticas debido a su mayor eficacia clínica sobre los anticuerpos monoclonales nativos. La conjugación con drogas a menudo resulta en una molécula ADC que es heterogénea tanto frente a la distribución como a la  carga de drogas citotóxicas en el mAb.  Se ha demostrado que la cantidad de droga unida al mAb afecta directamente a la seguridad y eficacia de la droga. Por lo tanto resulta crítico caracterizar y controlar completamente la heterogeneidad de los ADCs durante el desarrollo y producción. La cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) y la Cromatografía de Fase Inversa (RPC) resultan adecuadas en la separación de ADCs puesto que la unión de drogas tóxicas altera la hidrofobicidad del anticuerpo. En general el anticuerpo no conjugado menos hidrofóbico eluye antes y a medida que el número de drogas unidas aumenta el tiempo de retención aumenta también.

Análisis de ADCs mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)

La columna MAbPac HIC-Butyl se basa en una fase de partículas poliméricas no porosas de 5 µm funcionalizadas con grupos butilo. La resina hidrofóbica ofrece biocompatibilidad mientras que la densidad óptima de grupos butilo ofrece separaciones de alta resolución. Una muestra de ADCs miméticos se ha analizado con una columna MAbPac HIC-Butyl. Los ADCs miméticos se conjugaron entre una droga mimética y un mAb vía el grupo sulfhidrilo de residuos intercadena de cisteína con el resultado de una mezcla de especies anticuerpo-droga con una carga entre 0 y 8 drogas (Ver Figura 1). El mAb no modificado y los ADCs con DAR (relación Droga/Anticuerpo) entre 2 y 8 se resuelven bien en una columna MAbPac HIC-Butyl. (Ver Figura 2)

Análisis de ADCs mediante Cromatografía de Fase Inversa (RPC)

La columna  MAbPac RP se basa en una fase de partículas poliméricas supermacroporosas de 4 μm. La resina hidrofóbica fenílica con su gran tamaño de poro permite la separación eficiente de moléculas grandes como los mAbs y sus conjugados. En el cromatograma se muestra un ADC creado con tecnología de marcaje sitio-específico de anticuerpos analizado con una columna  MAbPac RP. Los ADCs se prepararon activando enzimáticamente los glicanos del dominio Fc con azida y uniéndolos a MMAE. Con galactosidasa se escinde un resto de glicano y con el enzima beta-galactosiltransferasa se incorpora un mutante modificado con azida. Los anticuerpos modificados activados se conjugan con  la toxina  dibenzociclooctina (DIBO) -Val-Cit-PAB-Monometil Auristatina E (MMAE)  con el resultado de una mezcla de anticuerpos cargados con 0 a 4 moléculas MMAE (ver Figura 3). El mAb sin modificar y los ADCs con DAR entre 0 a 4 se resuelven bien en la columna  MAbPac RP.

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Más Información

Visite las siguientes entradas si desea más información sobre las nuevas columnas para biocromatografía de Thermo Scientific:

• Determinación de la Concentración de mAb por Cromatografía de Afinidad)
• Separación de Agregados por Cromatografía de Exclusión (SEC)
• Análisis de Variantes de Carga por Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC)
• Análisis de Variantes por Oxidación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)
• Análisis de Conjugados Anticuerpo-Droga (ADC) por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) y de Fase Inversa (RP)
• Análisis de mAB’s Intactos y Fragmentos de mAb’s por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
• Mapa de Péptidos por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
• Análisis de Glicanos por Cromatografía de Modo Mixto (MMC) y Cromatografía de Interacción Hidrofílica (HILIC)

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