La columna Thermo Scientific™ Acclaim™ AmG C18 es una columna de Fase Inversa C18 basada en sílice especialmente diseñada para el análisis de Antibióticos Aminoglucósidos por Cromatografía de Fase Inversa y Par Iónico (IP-RPLC). Esta columna permite la determinación de la pureza, la caracterización y cuantificación de impurezas, el control terapéutico y residual en varias matrices . Su química única permite una tolerancia inusual en condiciones de pH muy bajo, a alta temperatura y con fases móviles acuosas.
Acclaim™ AmG C18 permite:
- Selectividad excelente para aminoglucósidos
- Superior tolerancia a condiciones ácidas
- Elevada eficacia y velocidad
- Facilidad de uso
Introducción
Los aminoglucósidos son un grupo de antibióticos cuyas estructuras contienen uno o varios aminoazúcares, y se usan ampliamente en clínica y veterinaria para tratar infecciones gracias a su capacidad de inhibir la síntesis de proteínas. Sin embargo esos antibióticos tienen fuertes efectos secundarios y pueden causar varios grados de ototoxicidad y nefrotoxicidad por lo que resulta importante desarrollar métodos analíticos fiables para su determinación y control en varias matrices como sangre, orina y alimentos derivados de animales.
La Cromatografía Líquida de Fase Inversa por Par Iónico (IP-RPLC) se usa para el análisis de aminoglucósidos debido a su naturaleza hidrofílica y catiónica. Además estos compuestos son poco solubles en muchos solventes orgánicos que hace que la separación HILIC sea complicada. Además su falta de cromóforos hace imposible su detección UV, por lo que el usos de detectores CAD (detector corona), ELSD (detector por dispersión de luz), MS y electroquímicos son los usualmente utilizados para este tipo de compuestos.
Tecnología de Columna
La columna Acclaim AmG C18 ha sido específicamente diseñada para el análisis por IP-RPLC de antibióticos aminoglucósidos con ácidos perfluorados volátiles como TFA 100 mM (Ácido Trifluoroacético).
La separación bajo estas condiciones ácidas es difícil con columnas C18 convencionales debido a su inestabilidad por hidrólisis de la fase estacionaria.
Acclaim AmG C18 usa una tecnología de enlace propia que permite una estabilidad extrema frente a condiciones ácidas, exhibe una selectividad excelente y alta resolución en la separación de antibióticos aminoglucósidos y es de uso fácil ya que requiere una fase móvil acuosa simple (p.e. TFA 100 mM) sin solvente orgánico y con un tampón de ajuste de pH en la mayoría de los casos.
Estabilidad Excelente a bajo pH
La separación de antibióticos aminoglucosidos por IP-RPLC se efectúa en condiciones de pH bajo por lo que la estabilidad de la fase estacionaria resulta vital en estas aplicaciones.
Las columnas Acclaim AmG C18 usan una fase basada en sílice encapsulada en polímero, unida covalentemente a ligandos C18. La capa polimérica protege al enlace polisiloxano de la superficie de la sílice y evita su hidrólisis a pH ácido.
La Figura 2 ilustra la estabilidad hidrolítica de la columna Acclaim AmG C18 frente a una columna C18 convencional en condiciones ácidas (TFA 100 mM) y alta temperatura (80°C). Durante el período de prueba de 100 horas Acclaim AmG C18 mantuvo una retención constante en comparación con otras columnas C18 que mostraban una disminución en la estabilidad de retención superior al 50%.
Además, cuando la separación de aminoglucósidos se realiza a baja temperatura (30°C) en condiciones ácidas (ver Figura 3), la estabilidad de la columna Acclaim AmG C18 es significativamente mejor que la de cualquier otra columna C18. En la comparativa todas las columnas se expusieron a TFA 100 mM durante 50h. Como compuesto de control se usó gentamicina y el tiempo de retención de Gentamicina C1 fue más estable que con cualquier otra columna, demostrando que Acclaim AmG C18 es la columna más robusta para el análisis de antibióticos aminoglucósidos por IP-RPLC.
Aplicaciones
Análisis de Gentamicina
La Gentamicina es un antibiótico de amplio espectro ampliamente usado que se produce por fermentación con Micromonospora Purpurea y consiste en una mezcla de componentes y fracciones que componen el complejo Gentamicina C, y son gentamicina C1, gentamicina C1a, y gentamicina C2.
La Figura 4 muestra la separación isocrática de sulfato de gentamicina con una fase móvil simple (TFA 100 mM) y detector CAD en la que los cinco congéneres (C1, C1a, C2, C2a, y C2b) están bien separados. La resolución entre los isómeros (C2, C2a, y C2b) es de, al menos, 3. Además más de 20 picos menores se observan como impurezas o como substancias relacionadas con la gentamicina. Se puede disminuir el tiempo de análisis añadiendo un pequeño porcentaje de solvente orgánico en la fase móvil. Por ejemplo la separación isocrática se completa en menos de 25 minutos si se añade un 2% de acetonitrilo en TFA 100 nM (Figura 4B). Cuando se aplica una elución por gradiente (con una pendiente de 0.5% ACN/Min), la separación se realiza en menos de 15 minutos y si se compara con la separación en isocrático (Figura 5A) se obtienen picos más estrechos y simétricos.
La Figura 6 muestra la separación de gentamicina a diferentes temperaturas y resulta evidente que el análisis puede efectuarse en esas condiciones sin comprometer ni la resolución ni las prestaciones de la columna.
Análisis de Sisomicina, Netilmicina, y Etimicina
La Sisomicina, Netilmicina, y Etimicina son un grupo de aminoglucósidos estructuralmente relacionados con la gentamicina. La Sisomicina es un antibiótico de amplio espectro aislado del fermentado con Micromonospora. La Netilmicina es un antibiótico semi-sintético producido a partir de la Sisomicina y ambos se usan en el tratamiento de infecciones severas, especialmente las resistentes a la Gentamicina. La Etimicina es también un antibiótico semi-sintético producido a partir de Gentamicina C1a.
La Figura 7 muestra la separación isocrática de la Sisomicina (1), Netilmicina (2), y Etimicina (3) individualmente y en mezcla. A pesar de las estructuras íntimamente relacionadas de estos tres antibióticos la columna Acclaim AmG C18 los puede resolver completamente en condiciones isocráticas con TFA 100 mM como fase móvil. La resolución entre los picos de Sisomicina (1) y Netilmicina (2) es 24.4, que alcanza los criterios (mínimo 3.0) definidos en la Farmacopea Europea (EP).
Separación de Amikacina, Kanamicina, Tobramicina, y Arbekacina
La Amikacina es un antibiótico semi-sintético producido a partir de la Kanamicina, que, a su vez, es un antibiótico aminoglucósido aislado de la bacteria Streptomyces Kanamyceticus. La Tobramicina deriva de Streptomyces Tenebrarius y posee un rango terapéutico estrecho frente a las infecciones Gram-negativas. La Arbekacina es un antibiótico semi-sintético producido a partir de la Dibekacina. Esos antibióticas pertenecen al grupo de Kanamicina y tienen la misma estructura básica con diferentes grupos laterales. La Figura 8 muestra separaciones de esos antibióticos en una columna Acclaim AmG C18 con TFA 100 mM como eluyente con un método simple. Además de los picos principales se observan varios picos de pequeñas impurezas.
La Amikacina y la Kanamicina son los aminoglucósidos menos retenidos a causa de su hidrofilicidad. Para superar el este reto se usan reactivos de par iónico mucho más fuertes en la fase móvil como el ácido pentafluoropropiónico (PFPA) o heptafluorobutírrico. Por ejemplo añadiendo HFBA 5 mM en la fase móvil (TFA 100 mM), se puede aumentar de 4 a 5 veces sus factores de capacidad (k’).
Separación de Estreptomicina y Dihidroestreptomicina
La Estreptomicina es el primer antibiótico de la clase aminoglucósido en ser descubierto y ser usado en terapia clínica y deriva de Actinobacterium Streptomyces Griseus. La Dihidroestreptomicina se forma por reducción de la estreptomicina y, por lo tanto, ambas tienen estructuras, propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas y actividad antimicrobiana similar. La Figura 9 muestra la separación isocrática de esos antibióticos con la columna Acclaim AmG C18. A pesar de que sus estructuras son sólo ligeramente diferentes se resuelven fácilmente en IP-RPLC. Además esta columna también separa muchos picos de pequeñas impurezas del pico principal del API- El pico no resuelto de la dihidroestreptomicina mostrado en la Figura 8 puede aislarse usando al menos HFBA 2 mM en la fase móvil (TFA 100 mM), con una resolución superior a 2.0.
Separación de Ribostamicina, Paromomicina, y Neomicina
La Ribostamicina es un antibiótico aminoglucósido biosintetizado y aislado de un estreptomiceto. Es un importante antibiótico de amplio espectro usado contra el virus de la inmunodeficiencia humana y está formado por una mezcla de aminoglucósidos A, B y C, en la que la neomicina B es mayoritaria. La paromomicina tiene una acción muy similar a la neomicina. La Figura 10 muestra una separación por IP-RPLC de los tres antibióticos y de la mayoría de los picos de impurezas resueltas de los picos de los API. La neomicina C es la mayor impureza de la neomicina y se resuelve de la neomicina B con una resolución de 3.0 alcanzando el requerimiento definido en EP (mínimo de 2.0).
Análisis de Espectinomicina
La Espectinomicina es un antibiótico de amplio espectro de tipo aminociclitol aislado del fermentado de Streptomyces Spectabilis, y es una mezcla de compuestos relacionados biosintéticamente. La Figura 11A ilustra una separación típica de Dihidrocloruro de Espectomicina con TFA 100 mM en elución isocrática. Además del pico principal (espectomicina) se detectan un par de picos menores correspondientes a substancias y/o impurezas totalmente resueltas del pico mayoritario. Para resolver totalmente el par crítico formado por los picos 1 y 2 se puede añadir a la fase móvil PFPA o HFBA, puesto que estos reactivos de par iónico más fuertes no sólo incrementan la retención de los aminoglucósidos sino que, además, ajustan la selectividad entre los antibióticos. La separación de espectomicina con HFBA 5 mM en combinación con TFA 95mM como fase móvil puede verse en la Figura 10B. Aunque el tiempo de análisis aumenta, la resolución entre los pares críticos también se incrementa de 1.2 a 1.8.
Separación de Apramicina
La Apramicina se usa ampliamente como medicamento en veterinaria para tratar infecciones bacterianas en animales (p. ej. ganado, cerdos, pollos) y se produce de una cepa de Streptomyces Tenebrarius. La Apramicina se identifica como residuo marcador en tejidos animales. La figura 12A muestra la separación de sulfato de Apramicina en condiciones isocráticas con TFA 100 mM y se observan pequeños picos de impurezas. La separación del pico de la impureza que no se resuelve del pico principal de la apramicina puede mejorarse añadiendo HFBA 4 mM a la fase móvil, incrementando la resolución hasta aproximadamente 1.0 (Ver Figura 12B).
Fabricación Reproducible
Cada columna Thermo Scientific™ Acclaim™ AmG C18 se produce bajo estrictas especificaciones para asegurar una reproducibilidad columna a columna.
Cada columna se comprueba individualmente y se envía conjuntamente con un certificado de aseguramiento de la calidad.
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