Aunque se considera que la tecnología de las columnas para Cromatografía Líquida de Altas Prestaciones (HPLC) es relativamente madura, los nuevos desarrollos en el diseño del material de relleno, en la química de enlace de la fase, en el diseño de las columnas y en sus nuevos formatos, están a la orden del día.
Los usuarios tienen ahora un mejor conocimiento de las ventajas y limitaciones de los materiales basados en sílice, y ya nos los utilizan en condiciones que puedan acortar su vida o limitar sus prestaciones, pese a que el desarrollo de nuevas fases ha permitido extender el rango de pH, la versatilidad y la vida útil de las columnas HPLC.
Mejoras en soportes porosos
Pese a que las primeras fases disponibles en Cromatografía Liquida hacia finales de los 60 fueran del tipo pelicular con partículas entre 40 y 50 μm, los soportes porosos han sido los más utilizados durante la historia de la HPLC.
A partir de los 70, en cuanto se dispuso de geles de sílice microparticulados (dp<10 μm) y se desarrollaron nuevos métodos de empacado de columnas, se produjo la transición desde materiales peliculares hacia partículas porosas de bajo diámetro, y, posteriormente al desarrollarse materiales de partícula esférica, hacia las columnas actuales.
Los soportes esféricos se pueden empacar de manera más homogénea que los anteriores de tipo irregular, producen mayores eficacias y pueden fabricarse con mayor pureza, y, hacia los 90, la sílice de Tipo B, con bajo contenido en metales, se impuso como material de empacado por excelencia.
El objetivo, evidentemente, ha sido conseguir la máxima eficacia posible para obtener una mayor resolución cromatográfica. Veamos brevemente la morfología de los diferentes tipos de soportes como gel de sílice o alúmina.
Soporte Poroso
Como el tiempo en que el soluto interacciona internamente en los poros no es el mismo que el de la interacción superficial, se produce el ensanchamiento de la banda (ver Figura 2).
El uso de partículas más pequeñas (3, 1.9, 1.7μm) acorta las longitudes de los caminos de este proceso de difusión, mejora la transferencia de masa y la eficacia a costa de una disminución de la permeabilidad, con el consiguiente aumento de la contrapresión.
La ecuación de Burke-Plummer muestra la dependencia de la pérdida de carga a lo largo de la columna en función de una serie de parámetros experimentales, como la longitud y diámetro de la columna, la viscosidad de la fase móvil y el tamaño de la partícula. Hay que tener en cuenta que existen otros factores extracolumnares que pueden afectar la pérdida de carga como la longitud y diámetro interno de los tubos de interconexión, el tamaño de la celda (en un DAD) o la longitud de los capilares en la fuente ESI o APCI en un LCMS.
La eficacia de la columna, H o HETP (Altura Equivalente a un Plato Teórico), es proporcional al diámetro de la columna, mientras que la resolución es proporcional a N½.. Por lo tanto el uso de partículas pequeñas con columnas cortas del mismo diámetro interno implica que la resolución no caiga tan rápidamente como mejora la eficacia. La tendencia actual es el uso de columnas cortas con partículas pequeñas (50×4.6mm y 1.9 μm) y no columnas largas con partículas mayores (250×4.6mm y 5 μm). Puesto que el tiempo de separación es proporcional a la longitud de la columna, columnas cortas permiten separaciones más rápidas (ver Figura 3).
Sin embargo, aunque columnas cortas con partícula pequeña permiten análisis más rápidos, el número de platos (eficacia) no aumenta. Por esta razón muestras multicomponentes complejas no siempre se separan en estas columnas, y suele ser necesario aumentar la longitud de la columna, a expensas de un aumento substancial de la presión en columna.
Soporte de Perfusión
Los soportes de perfusión desarrollados en los 80, permiten unas buenas prestaciones cromatográficas, especialmente con moléculas grandes (ver Figura 1.1). En comparación con los rellenos porosos, los de perfusión tienen dos tipos de poro: los difusivos y los de permeación. Los difusivos son similares a los presentes en los rellenos de tipo poroso y ofrecen interacciones similares. Los de permeación permiten que la fase móvil pase a través del relleno aumentando la transferencia de masa. Una parte de la fase móvil atraviesa la partícula en lugar de fluir alrededor de ella, permitiendo que el soluto esté menos tiempo en el proceso de transferencia de masas generando picos más estrechos.
En general los soportes de perfusión se basan en partículas poliméricas de unos 12μm de diámetro. En comparación con soportes porosos del mismo tamaño, los de perfusión ofrecen una mayor eficacia con moléculas grandes.
Soportes Monolíticos
Los monolitos son columnas que se fabrican con fases homogéneamente continuas (como el yeso en un molde) y no con partículas individuales y pueden fabricarse con base polimérica o sílice.
Son similares a los rellenos de perfusión y tienen poros de permeación de 1-2 μm de anchura y de difusión (mesoporos) de unos 13 nm de anchura. Las barras de sílice pueden modificarse con las misma químicas que normalmente se usan en HPLC como C18 o C8.
Las columnas monolíticas de sílice tienen dos características importantes: tienen la eficacia equivalente a las partículas de sílice de 3-5 μm con una pérdida de carga entre un 40-50% inferior a las columnas tradicionales de 5 μm con lo que pueden conectarse en serie para generar los platos necesarios en separaciones difíciles a caudales de 3-5 mL/min.
Las columnas monolíticas de base polimérica consisten en un polímero entrelazado poroso continuo del tipo polimetacrilato o copolímeros de metilacrilato. Existen varios monolitos poliméricos con interacciones de intercambio, hidrofóbicas y de afinidad. En general los monolitos poliméricos parece que son mejores en la separación de biomoléculas grandes y son complementarios a los basados en sílice.
Columnas Superficialmente Porosas
El uso de Partículas Superficialmente Porosas, o Peliculares, con diámetros entre 2 y 3 μm, e inferiores, están despertando interés, pues ofrecen eficacias similares a las columnas con partículas <2 μm pero con significativamente menor pérdida de carga.
Las columnas Accucore con tecnología CET (Core Enhanced Technology) son un nuevo desarrollo de Thermo Scientific en fases con partículas de porosidad superficial, pero con un enfoque totalmente nuevo en la distribución de las partículas porosas sobre el núcleo sólido que permite unas prestaciones superiores a las que se obtienen con las columnas peliculares actuales.
El estricto control del diámetro de las partículas superficiales ofrecido por la tecnología CET y un proceso de empacado totalmente automatizado permiten un lecho denso altamente uniforme que minimiza la difusión de Eddy.
El enfoque convencional al comparar las prestaciones cromatográficas de columnas es trazar el gráfico de la eficacia normalizada (HETP) como función del caudal de fase móvil o velocidad lineal: este gráfico se le conoce como Gráfico de Van Deemter (Figura 5).
Sin embargo existen limitaciones puesto que este tipo de representación no tienen en cuenta otros parámetros como el tiempo de análisis o las restricciones de presión del sistema cromatográfico. Los gráficos cinéticos representan un método alternativo que permiten incorporar otros parámetros como la presión. En una de de las formas más útiles de gráficos cinéticos se usa un término denominado Impedancia que define la resistencia a la que es sometido un compuesto mientras se mueve por la columna, relativa a las prestaciones de la misma.
DP = Pérdida de Carga
t = Tiempo muerto del sistema cromatográfico
n = Viscosidad cinemática de la fase móvil
N = Eficacia
Este término da una medida verdadera de las prestaciones de la columna pues incorpora eficacia, tiempo y presión que son las consideraciones prácticas críticas en una separación cromatográfica. Un valor bajo indica una cromatografía más rápida y la generación de picos más estrechos a menores contrapresiones.
Comparación de la Impedancia
La nueva tecnología CET de las columnas Accucore contribuye a una baja impedancia como se muestra en la figura. Las columnas Accucore de 2.6 μm muestran una impedancia media inferior en un 7% a la siguiente (Halo 2.7 μm) y un 51% inferior que el material con mayor impedancia (Poroshell 120 2.7 μm). Ver Figura 6.
Comparación de la Pérdida de Carga
El uso de partículas superficialmente porosas, con diámetros entre 2 y 3 mm, e inferiores, y la nueva tecnología CET, permite que las columnas Accucore generen contrapresiones normalmente inferiores que otras columnas peliculares. La figura muestra que, a excepción de SunShell® (ChromaNik Technologies, Inv., Osaka, Japón), la columna Accucore muestra la menor contrapresión a lo largo del rango de caudal (0.1 a 1.0 mL/min). Sin embargo el material SunShell® muestra eficacias menores.
A 1 ml/min la contrapresión generada por una columna Accucore de 100×2.1mm está por debajo de 500 bar. Esta presión es un 22% menor que la columna Porosell® 120 de 2.7 μm (Agilent Technologies Inc. Santa Clara, CA, USA) en las mismas condiciones. La columna Porosell® 120 es la que genera la mayor contrapresión a lo largo del rango de caudal medido..
Comparación de la Eficacia
En la Figura 8 se muestra la velocidad a la que genera platos una columna Accucore frente a otras fases peliculares. Este gráfico cinético se denomina también como Gráfico de Poppe y representa la velocidad de generación de platos frente la eficacia. Los valores más bajos en el eje de la Y representan la facilidad de generar rápidamente picos estrechos y la columna Accucore es la más eficiente entre las columnas analizadas. En el punto óptimo de la curva, la columna Accucore de 2.6 mm muestra la mejor combinación de velocidad de generación de platos frente a eficacia. En media, la velocidad de generación de platos de Accucore de 2.6 μm , Halo 2.7 μm (Advanced Materials Technology, Inc., Wilmington, DE, USA) y Ascentis® Express 2.7 μm (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) son similares y un 28% mejores que la peor columna (Sunshell 2.6 μm ).
Capacidad de carga
Los soportes peliculares, también conocidos como de porosidad superficial o de núcleo duro, han mostrado una mayor eficacia frente a los soportes totalmente porosos, pero adolecían, a causa de su baja área superficial específica, de una buena capacidad de carga. La nueva tecnología de empacado denso en las columnas Accucore, permite incrementar la capacidad de carga de manera substancial sin perder retención y forma de pico. Ver Figura 9.
Columnas comparadas en el Test
La Tabla 1 muestra las columnas de Partículas Superficialmente Porosas que se han comparado en este test.
Conclusiones
- Las columnas Accucore generan una menor contra presión que la mayoría de las columnas competidoras de núcleo duro
- Las columnas Accucore generan una mayor eficacia que cualquier columna competidora de núcleo duro
- Las columnas Accucore generan una menor impedancia que cualquier columna competidora de núcleo duro
