¿Qué es la Cromatografía FLASH?
La Cromatografía FLASH es un método de purificación de compuestos de síntesis que se basa en Cromatografía de Líquidos de Media Presión, a diferencia de los sistemas tradicionales por gravedad en columna que son mucho más lentos e ineficientes.
La Cromatografía FLASH difiere de la cromatografía tradicional en columna básicamente por el mayor tamaño de las partículas del soporte, y en la menor contrapresión generada que no obliga al uso de una fuente de presión para generar el caudal de fase móvil necesario en columna.
Sin embargo, de la misma manera que la Cromatografía de Líquidos ha ido evolucionando, la Purificación FLASH ha seguido un camino paralelo.
El resultado final en una separación rápida (FLASH) y de alta resolución.
Ultra Performace Flash Purificacion (UPFP) se basa en dos conceptos:
- Uso de Columnas FLASH de Alta Eficacia y Empacado optimizado
- Equipos FLASH con bombas de media y alta Presión (de 15 a 250 bar) y altos caudales estables (200-250 mL/min con H2O o IPA)
El ejemplo muestra la separación de una mezcla de dietil y dimetil ftalato en condiciones isocráticas (ciclohexano/etil acetato 85:15). A un caudal de 30 mL/min la contrapresión generada por las columnas de 50, 30 y 15 mm es respectivamente de 0.34, 1.03 y 19.65 bar.
El resultado es un aumento de la pureza y velocidad al disminuir el tamaño de la partícula de la columna (PF-15SIHP/12G de 15 μm).
Eluyentes
La Cromatografía FLASH es una evolución de la cromatografía en columna que todavía es de uso general en los laboratorios de síntesis orgánica.
En general el compuesto de interés, separado por TLC, ha de tener un Rf de 0.15 a 0.20 con el soporte y fase móvil seleccionada. La fase móvil usualmente es binaria con uno de los dos solventes de mayor polaridad para permitir ajustar fácilmente la polaridad media y optimizar la separación.
En FLASH la fase estacionaria más usada es gel de sílice por lo que al aumentar la polaridad del solvente aumenta la velocidad de elución de todos los componentes de la mezcla. Las fases móviles binarias de polaridad creciente más usuales son cloruro de metileno/hexano, éter etílico/hexano, hexano/etil acetato y cloruro de metileno/metanol. Estas fases móviles, excepto hexano/etil acetato, obligan a trabajar en campana de seguridad.
En general si Rf ~0.2 será necesario usar un volumen de solvente equivalente a 5 veces el volumen del lecho de la columna para completar la separación.
En FLASH instrumental las mezclas pueden ser más complejas: algunos instrumentos permiten el control de hasta cuatro eluyentes diferentes.
El ejemplo muestra de nuevo la separación de una mezcla de dietil y dimetil ftalato en condiciones de gradiente (ciclohexano:etil acetato 100:0 a 85:15 en 7′ + 13′) y gradiente optimizado.
A un caudal de 30 mL/min la contrapresión generada por las columnas de 50, 30 y 15 mm es respectivamente de 0.34, 1.03 y 19.65 bar.
Estas prestaciones sólo se pueden conseguir con equipos FLASH de segunda generación como puriFlash™ 215, 430, 450, 4100 o 4250.
Masa de Fase o de Lecho
La cantidad de fase en la columna necesaria para una buena separación depende la diferencia de Rf entre los compuestos a separar, de su cantidad, de la geometría de la fase y de su empaquetado.
En general por cada gramo de producto se requiere entre 30 y 100g de soporte en una columna tradicional. En las columnas especialmente diseñadas y empacadas para FLASH la capacidad de carga puede expresarse como un porcentaje de la masa de soporte: por ejemplo la serie puriFlash HC de SiO2 esférica de 50 µm de Interchim puede soportar ¡hasta el 20% de la masa de soporte en producto!
Una columna tradicional por gravedad de gel de sílice de 40g, en el mejor de los casos tiene una capacidad de carga de 1.35g.
Una columna PF-50SIHC/40 de 40g puede admitir ¡hasta 8g de producto!
Empacado de la columna
Uno de los mayores problemas en la cromatografía FLASH instrumental surge de la calidad de la fase y del empacado de la columna. Una columna mediocremente realizada o empacada con fases de granulometría dispersa genera una menor reproducibilidad que la que se obtiene con partículas perfectamente caracterizadas lote a lote y procedimientos de empacado desarrollados en la producción de columnas analíticas y semipreparativas de alta calidad. Interchim no solo es uno de los mayores fabricantes de columnas de HPLC sino que además produce soportes con tecnología propia y estrictos controles de calidad, que aplica en la producción de columnas FLASH para garantizar la máxima calidad y prestaciones constantes lote a lote.
El ejemplo muestra la diferencia en prestaciones entre una columna FLASH económica y la columna equivalente PF-50SIHP/40G: no sólo la eficacia es superior a caudal equivalente sino que, además, el consumo de eluyente se reduce en un 30%.
Usando columnas de menor tamaño de partícula y equipos FLASH de última generación, la velocidad de la separación aumenta ¡en un factor de 3X!.
Instrumentación
La instrumentación necesaria en cromatografía FLASH puede ser tan simple como una bomba isocrática (ver puriFlash™ Minibox) combinada con una columna FLASH tipo PF-50SIHC/40, o un sofisticado sistema (ver puriFlash™ 430 o puriFlash™ 450) dotado de una bomba cuaternaria y generador de gradientes hasta 250 mL/min y 250 bar, detector UV con software de detección automática de picos, colector de hasta 176 fracciones, y capacidad de operar con columnas de 2.5g a 1.2Kg que permiten purificar desde 0.5 g hasta 240 g de producto.
La ventaja de operar a mayores presiones que los instrumentos actualmente disponibles es tan grande como ¡multiplicar X3 la velocidad de análisis o reducir un 30% el uso de eluyentes!
Para aplicaciones de gran tamaño puriFlash™ 800 es la solución ideal o para aquellos usuarios con presupuesto limitado pero que quieran obtener las ventajas de la UPFP el modelo puriFlash™ 215 cumplirá con las expectativas de las purificaciones más exigentes.
En 2012 han sido presentados el equipo puriFlash™ PF4100 que, demás de ofrecer prestaciones UPFP, permite LC-PREP con columnas estándar hasta 10 μm, y el modelo puriFlash™ PF4250-250 para purificaciones a escala laboratorio, con capacidad plena para columnas de 5 um hasta 80mm D.I. y a una fracción del coste de un equipo para cromatografía preparativa tradicional…
Además del sistema estándar de detección basado en Detectores UV-Vis DAD, Interchim dispone de Detectores ELSD y el nuevo MSD Cuadropular Ultra Compacto especialmente adaptado para Cromatografía FLASH y Preparativa.
PuriFLASHTM PF215
El equipo puriFlash™ 215 ha sido diseñado para aquellos usuarios que quieran purificar sus compuestos de síntesis mediante cromatografía FLASH y dispongan de un presupuesto limitado o no necesiten capacidades de purificación demasiado elevadas:
- Uso Académico
- Purificaciones de Rutina
- Instalaciones múltiples compartidas
- Equipo de introducción a purificación FLASH instrumental
- Columnas FLASH hasta 800g
- Compatible con cualquier columna o método
- UPFP con columnas PF de 15μm
- ¡Modular!
PuriFLASHTM PF430
El equipo puriFlash™ 430 es el primer equipo diseñado bajo el concepto UPFP (Ultra Performance Flash Purification).
- UPFP con columnas PF de 15μm
- Purificaciones de Rutina y Escala Laboratorio
- Instalaciones múltiples compartidas
- Columnas FLASH hasta 1600g
- Compatible con cualquier columna o método
- HPLC semi preparativa (depende de la fase y dimensiones de columna)
- ¡Modular!
PuriFLASHTM PF450
El equipo puriFlash™ 450 es el primer equipo que soporta plenamente el concepto UPFP (Ultra Performance Flash Purification).
- UPFP 3XSPEED con las nuevas columnas PF de 15μm
- Purificaciones de Rutina y Escala Laboratorio
- Instalaciones múltiples compartidas
- Columnas FLASH hasta 1600g
- Compatible con cualquier columna o método
- Válvula de Inyección Automática
- HPLC semi preparativa con columnas de hasta 80mm D.I. (depende de la fase)
- ¡Modular!
PuriFLASHTM PF800
El equipo puriFlash™ 800 es el equipo asequible para Cromatografía FLASH de gran escala.
- Columnas hasta 150mm D.I.
- Purificaciones de Gran Escala
- Instalaciones múltiples compartidas
- Columnas FLASH de más de 1.6 kg
- Compatible con cualquier columna o método
- Disco de lavado que permite los eluyentes de Fase Inversa necesarios para la purificación de biomoléculas
PuriFLASHTM PF4125
El equipo puriFlash™ 4125 es el primer equipo que soporta plenamente el concepto UPFP (Ultra Performance Flash Purification) y HPLC Preparativa.
- UPFP 3XSPEED con las nuevas columnas PF de 15μm
- Purificaciones de Rutina y Escala Laboratorio
- Instalaciones múltiples compartidas
- Columnas FLASH hasta 1600g
- Compatible con cualquier columna o método
- HPLC Preparativa con columnas de hasta 80mm D.I. y 10 μm
- ¡Modular!
PuriFLASHTM PF4250
El equipo puriFlash™ 4250-250 es el primer equipo que soporta plenamente el concepto UPFP (Ultra Performance Flash Purification) y HPLC Preparativa con una relación precio/prestaciones extraordinaria.
El equipo ideal para purificaciones sofisticadas y de rutina y LC-Preparativa.
- UPFP 3XSPEED con las nuevas columnas PF de 15μm
- Purificaciones de Rutina y Escala Laboratorio
- Instalaciones múltiples compartidas
- Columnas FLASH hasta 1600g
- Compatible con cualquier columna o método
- HPLC Preparativa con columnas de hasta 80mm D.I.
y 5 mm - ¡Modular!